1.4.2 Podmínky testu
1.4.2.1 Rozpouštědlo
U zvoleného rozpouštědla nesmí existovat podezření, že by mohlo s testovanou látkou chemicky reagovat, a nesmí narušovat přežívání buněk a aktivitu S9. Používá-li se méně známé rozpouštědlo musí být podpořeno referencemi prokazujícími jeho kompatibilitu. Doporučuje se, aby všude tam, kde je to možné, bylo na prvním místě zvažováno použití jako rozpouštědla vody. Je-li testovaná látka ve vodě nestálá, musí být použité organické rozpouštědlo zcela bezvodé. Voda se dá odstranit molekulárním sítem.
1.4.2.2 Koncentrace
Mezi kritéria, jež se uvažují při stanovování nejvyšší koncentrace, patří cytotoxicita, rozpustnost v systému a změny pH resp. osmolality.
Cytotoxicita se stanoví s metabolickou aktivací i bez ní v hlavním experimentu, přičemž se použije vhodné indikace buněčné integrity a růstu, například stupně konfluence, počet živých buněk, nebo mitotický index. Je vhodné stanovit cytotoxicitu a rozpustnost v předběžných experimentech.
Je třeba použít minimálně tři analyzovatelné koncentrace. Dochází-li k cytotoxicitě, musí tyto koncentrace pokrývat rozsah od maximální do nízké nebo nulové toxicity. To obvykle znamená, že se jednotlivé koncentrace nebudou lišit více než násobkem, který leží mezi hodnotami 2 a √10. V době sklízení buněk musí být při nejvyšší koncentraci pozorován signifikantní pokles konfluentního růstu, počtu buněk, nebo mitotického indexu (vždy o více než 50 %). Mitotický index je pouze nepřímou mírou cytotoxických/cytostatických účinků a je závislý na době uplynulé po expozici testovanou látkou. Je však akceptovatelný pro suspenzní kultury, kde by jiná detekce toxicity byla obtížná a nepraktická. Jako doplňující informace je možno použít také údaje o kinetice buněčného dělení, jako je průměrný generační čas; ten ovšem představuje celkový průměr, který ne vždy odhalí existenci v dělení zpožděných subpopulací buněk. A tak i malé prodloužení průměrného generačního času může znamenat značný odklon od vhodné doby sklízení z hlediska optimálního výtěžku aberací.
U relativně necytotoxických látek činí maximální koncentrace testované látky nejnižší z hodnot 5 μl/ml, 5 mg/ml nebo 0,01 M.
U relativně nerozpustných látek, jež jsou netoxické v koncentracích nižších než je koncentrace při které se již látka nerozpouští, má být nejvyšší použitá koncentrace vyšší než je mez rozpustnosti ve finálním kultivačním médiu na konci kultivace s testovanou látkou. V některých případech - například dochází-li k toxickému účinku při koncentracích vyšších než je nejnižší nerozpustná koncentrace - se doporučuje testovat při několika koncentracích s viditelným srážením. Může být užitečné vyhodnotit rozpustnost na počátku a na konci působení, protože se během expozice může rozpustnost změnit v testovacím systému vlivem přítomnosti buněk, séra, S9 apod. Nerozpustnost se dá zjistit i prostým okem. Sraženina nesmí být na překážku při hodnocení buněk.
1.4.2.3 Negativní a pozitivní kontroly
Do každého experimentu, ať již s metabolickou aktivací nebo bez ní, je třeba zařadit souběžné pozitivní a negativní kontroly (rozpouštědlo, nebo vehikulum). Pokud se aplikuje metabolická aktivace, musí být pozitivní kontrolou látka vyžadující metabolickou aktivaci k vyvolání mutagenního účinku.
Pro pozitivní kontrolu se používá známý klastogen, a to při expozičních úrovních, kde se očekává, že poskytne reprodukovatelný a detekovatelný nárůst aberací nad pozadí, prokazující citlivost testovacího systému.
Koncentrace pro pozitivní kontrolu je třeba zvolit tak, aby účinek byl zřejmý, ale neodhaloval hodnotiteli přímo identitu zakódovaných preparátů. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:
+-------------+-------------------------+-----------+-----------+
| Metabolická | Látka | CAS | EINECS |
| aktivace | | | |
+-------------+-------------------------+-----------+-----------+
| Ne | methyl methansulfonát | 66-27-3 | 200-625-0 |
| +-------------------------+-----------+-----------+
| | ethyl methansulfonát | 62-50-0 | 200-536-7 |
| +-------------------------+-----------+-----------+
| | ethyl nitrosomočovina | 759-73-9 | 212-072-2 |
| +-------------------------+-----------+-----------+
| | mitomycin C | 50-07-7 | 200-008-6 |
| +-------------------------+-----------+-----------+
| | 4-nitrochinolin-N-oxid | 56-57-5 | 200-281-1 |
+-------------+-------------------------+-----------+-----------+
| Ano | benz[a]pyren | 50-32-8 | 200-028-5 |
| +-------------------------+-----------+-----------+
| | Cyklofosfamid | 50-18-0 | 200-015-4 |
| | monohydrát | 6055-19-2 | |
| | cyklofosfamidu | | |
+-------------+-------------------------+-----------+-----------+
Pro pozitivní kontrolu se mohou použít i jiné vhodné látky. Tam, kde je to možné, je vhodné použít pro pozitivní kontrolu látku ze stejné chemické skupiny.
Pro každý časový interval sklízení kultur je třeba použít i negativní kontrolu, ve které se používá rozpouštědlo nebo vehikulum v kultivačním médiu, zpracované stejným způsobem jako experimentální kultury. Mimoto je rovněž třeba zařadit kontrolu bez jakéhokoliv ovlivnění.