1.4.1 Příprava
1.4.1.1 Buňky
Je možno použít celou řadu buněčných linií, kmenů nebo primárních buněčných kultur, včetně buněk lidských (například fibroblasty čínského křečka nebo lymfocyty periferní krve člověka či jiného savce).
1.4.1.2 Média a kultivační podmínky
K udržování kultur je třeba používat vhodná kultivační média a inkubační podmínky (kultivační nádoby, koncentrace
CO
2,
teplota a vlhkost). U buněčných linií a kmenů je třeba běžným způsobem kontrolovat stabilitu modálního počtu chromozómů a nepřítomnost mykoplasmat v buňkách. V případě kontaminace se buňky nepoužívají. Je třeba znát normální dobu buněčného cyklu a kultivační podmínky.
1.4.1.3 Příprava kultur
Stabilizované buněčné linie a kmeny: buňky se množí ze zásobních kultur vysetím do kultivačního média v takové hustotě, aby kultury nedosáhly konfluentní vrstvy před dobou sklízení a inkubují se při teplotě 37 °C.
Lymfocyty: ke kultivačnímu médiu obsahujícímu mitogen (např. fytohemoglutinin) se přidá buď plná krev s vhodným antikoagulantem (např. heparinem) nebo separované lymfocyty získané od zdravých jedinců a kultivují se při teplotě 37 °C.
1.4.1.4 Metabolická aktivace
Na buňky se testovanou látkou působí v přítomnosti i v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Nejobvyklejší je kofaktory suplementovaná mitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců, ovlivněná činidly indukujícími enzymy jako je Aroclor 1254, nebo směs fenobarbitalu a β-naftoflavonu. 5)
Konečná koncentrace mitochondriální frakce v médiu činí obvykle 1 - 10 % v/v. Aktivita metabolického aktivačního systému bude záviset na tom, jakého typu je testovaná látka. V některých případech je vhodné použít mitochondriální frakci v několika koncentracích.
Pro účely endogenní aktivace mohou být použity i geneticky modifikované buněčné linie exprimující specifické aktivační enzymy. Výběr buněčných linií by měl být vědecky ověřen (např. vztahem isoenzymu cytochromu P450 k metabolismu testované látky).
1.4.1.5 Příprava testované látky
Je-li testovaná látka v pevném stavu, látka se před působením na buňky rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle a případně naředí. Kapalné testované látky se mohou do systému přidávat přímo nebo se předtím ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o jejich stabilitě prokazují, že delší skladování neovlivňuje jejich vlastnosti.