1.4.3 Postup
1.4.3.1 Expozice testovanou látkou
Na proliferující buňky se působí testovanou látkou za přítomnosti i nepřítomnosti metabolického aktivačního systému. Na lymfocyty je třeba začít působit asi 48 hodin po stimulaci mitogenem.
Obvykle se pro každou koncentraci používají dvě kultury; a totéž se doporučuje pro negativní kontroly s rozpouštědlem, nebo vehikulem. Pokud lze na základě historických údajů prokázat, že rozdíly mezi duplicitními kulturami jsou minimální, je přijatelné, aby se pro každou koncentraci použila jenom jedna kultura. 5)
V případě plynných nebo těkavých látek je třeba uplatnit v testu vhodné postupy, jako je použití neprodyšně uzavřených kultivačních nádob.
1.4.3.2 Doba sklízení kultury
V prvním experimentu se buňky vystaví testované látce s metabolickou aktivací i bez ní po dobu 3 - 6 hodin a vzorky se odebírají v čase odpovídajícím zhruba 1,5-násobku normální délky buněčného cyklu od začátku expozice. 5) Pokud jsou při použití aktivačního systému i bez něho výsledky negativní, provádí se další experiment bez aktivace, s kontinuální expozicí až do doby ukončení kultivace odpovídají zhruba 1,5-násobku normálního buněčného cyklu. Některé látky se hodnotí snáze při době expozice delší než je 1,5-násobek délky buněčného cyklu. Negativní výsledky s metabolickou aktivací se posuzují případ od případu. V případech, kdy se potvrzení negativních výsledků nepokládá za nutné, je třeba toto rozhodnutí zdůvodnit.
1.4.3.3 Příprava chromozómů
Na buněčné kultury se působí Colcemidem® nebo kolchicinem obvykle po dobu 1 - 3 hodin před ukončením kultivace. Každá buněčná kultura se pro přípravu chromozómů zpracovává zvlášť Příprava chromozómů sestává z ovlivnění buněk hypotonickým roztokem, fixace a obarvení.
1.4.3.4 Analýza
Všechny preparáty, včetně pozitivních a negativních kontrol, se před mikroskopickou analýzou nezávisle zakódují. Jelikož fixační postupy často vedou k rozbití určitého podílu metafázických buněk a ztrátě chromozómů, musí být u všech typů buněk počet centromer v hodnocených buňkách roven modálnímu číslu ± 2. Pro každou koncentraci a kontrolu je třeba hodnotit minimálně 200 dobře rozprostřených metafází, stejnoměrně z obou kultur, pokud byly použity.V případě, že je počet aberací vysoký, může se počet analyzovaných metafází snížit.
I když účelem testu je zjistit strukturální chromozómové aberace, je také důležité zaznamenat případnou polyploidii a endoreduplikaci.
------------------------------------------------------------------
5) Směrnice Komise 2000/32/ES, kterou se po dvacáté šesté přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování zákonů, právních předpisů a správních opatření týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 136 2000, metoda B13/14, B.39 a B.41 jsou upraveny směrnicí Rady 2001/59/ES).