5.2. Předhybridizace a hybridizace
5.2.1. Připraví se roztok lyzozymu obsahující 10 mg lyzozymu (Sigma L-6876) v 10 ml pufru (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Tento roztok lze skladovat, ale měl by se pouze jednou zmrazit a nechat roztát. Každý vzorek se dobře pokryje přibližně 50 μl roztoku lyzozymu a inkubuje po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Potom se ponoří sklíčka do demineralizované vody, pouze jednou, a osuší filtračním papírem.
Alternativně se přidá místo lyzozymu 50 μl proteinázy K 40 - 400 μg.ml-1 v pufru
(20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl , pH 7,4)
2
do každé jamky a inkubuje se při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.
5.2.2. Buňky se suší ve stupňovaných sériích 50%, 80% a 96% etanolu pokaždé po dobu 1 minuty. Sklíčka se nechají uschnout na vzduchu v držáku sklíček.
5.2.3. Připraví se vlhká inkubační komora zakrytím dna vzduchotěsné krabice tkaninou nebo filtračním papírem namočeným v 1x hybmixu (dodatek 7). Krabice se přeinkubuje v hybridizační peci při teplotě 55 °C po dobu alespoň 10 minut.
5.2.4. Připraví se hybridizační roztok (dodatek 7) s 45 μl na 1 sklíčko a předinkubuje se po dobu 5 minut při teplotě 55 °C.
5.2.5. Sklíčka se umístí na horkou plotnu při teplotě 45 °C a do každého ze 4 okének na sklíčku/sklíčcích se přidá 10 μl hybridizačního roztoku.
5.2.6. Každé sklíčko se přikryje 2 krycími sklíčky (24 x 24 mm) tak, aby pod ně nevnikl vzduch. Sklíčka se umístí do předehřáté vlhké komory a hybridizuje se 14 - 18 h v peci při teplotě 55 °C v temnu.
5.2.7. Připraví se 3 kádinky obsahující 1 l sterilní vody (Ultra pure water = UPW), 1 l 1x hybmixu (334 ml 3x hybmix a 666 ml UPW) a 1 l 1/2x hybmixu (167 ml 3x hybmix a 833 ml UPW). Každá z nich se přeinkubuje ve vodní lázni při teplotě 55 °C.
5.2.8. Sejmou se krycí sklíčka a podložní sklíčka se umístí do držáku sklíček.
5.2.9. Spláchne se nadbytek vzorku inkubací po dobu 15 minut v kádince s 1x hybmixem při teplotě 55 °C.
5.2.10. Držák sklíček se přemístí do promývacího roztoku 1/2 hybmix a nechá se inkubovat dalších 15 minut.
5.2.11. Sklíčka se ponoří krátce do UPW a položí na filtrační papír. Odstraní se nadbytečná vlhkost lehkým zakrytím povrchu filtračním papírem. Napipetuje se 5 - 10 μl krycího roztoku (např. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA nebo podobný) do každé jamky a celé sklíčko se zakryje velkým krycím sklíčkem (24 x 60 mm).