5.1. Fixace bramborového extraktu

5.1. Fixace bramborového extraktu

5.1.1. Připraví se fixační roztok (viz dodatek 7)

5.1.2. Napipetuje se 100 μl každého vzorkového extraktu do Eppendorfovy mikrozkumavky a odstřeďujte po dobu 8 minut na 7 000 g.

5.1.3. Odstraní se supernatant a rozpustí se peleta v 500 μl fixačního roztoku připraveného max. 24 hodin předem. Protřepe se a inkubuje se přes noc při teplotě 4 °C.

Alternativním fixačním činidlem je 96% etanol. Pro jeho použití se rozpustí peleta z kroku 5.1.2. v 50 μl 0,01 M PB a 50 μl 96% etanolu. Promíchá se protřepáním a inkubuje se při teplotě 4 °C po dobu 30 - 60 minut.

5.1.4. Odstřeďuje se po dobu 8 minut na 7 000 g, odstraní se supernatant a resuspenduje se peleta v 75 μl 0,01 M PB (viz dodatek 3).

5.1.5. Kápne se 16 μl fixované suspenze na čisté 10 okénkové sklíčko, jak ukazuje obrázek 3, přičemž se použijí 2 různé vzorky na jedno sklíčko, a to neředěný a zředěný 1:100 s použitím 10 μl (v 0,01 M PB). Zbývající roztok vzorku (49 μl) může být uložen při teplotě -20 °C po přidání 1 objemového množství 96% etanolu. V případě, že je třeba FISH metodu opakovat, odstraní se etanol odstředěním, přidá se stejné množství 0,01 M PB a zamíchá se protřepáním.

Obrázek 3. Rozmístění na sklíčku FISH

Obrázek 3

5.1.6. Sklíčka se nechají uschnout na vzduchu (nebo sušičkou sklíček při teplotě 37 °C) a fixují se nad plamenem.

V této fázi je možnost postup přerušit a pokračovat v hybridizaci další den. Sklíčka by měla být skladována chráněna před prachem a v suchu při pokojové teplotě.