5.3. Hodnocení FISH testu
5.3.1. Sklíčka se prohlížejí ihned s mikroskopem vhodným pro epifluorescenční mikroskopii se zvětšením 630x nebo 1 000x pod olejovou imerzí. S filtrem vhodným pro fluorescein isothiokyanat (FITC) jsou eubakteriální buňky (včetně většiny gramnegativních buněk) ve vzorku zbarveny fluorescenčně zeleně. Použitím filtru pro tetramethylrhodamin-5-isothiokyanat se buňky Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus obarvené Cy3 jeví fluorescenčně červené. Porovnává se buněčná morfologie s morfologií pozitivních kontrolních vzorků. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela zbarveny. Test FISH (oddíl 9.4) musí být zopakován, pokud je zbarvení odchylné. Prohlíží se okénka napříč dvěma průměry v pravých úhlech a kolem obvodu. U vzorků, kde nejsou pozorovány žádné nebo málo buněk, se pozoruje nejméně 40 polí mikroskopu.
5.3.2. Hledají se jasně fluoreskující buňky s morfologií charakteristickou pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus v okénkách testovacích sklíček (viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenzita fluorescence musí odpovídat nebo být lepší než u pozitivního kontrolního kmene. Buňky, které nejsou zcela zbarveny nebo vykazují slabou fluorescenci, se neberou v úvahu.
5.3.3. Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. To se může stát, když všechna sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky díky kontaminaci pufru nebo při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka sklíček) na povrchu sklíček.
5.3.4. Existuje několik problémů podstatných pro přesnost FISH testu. V peletách z pupkové části bramboru a částí stonku se mohou vyskytnout doprovodné populace fluoreskujících buněk s atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s velikostí a morfologií podobnou Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, ačkoli mnohem méně často než u IF testu.
5.3.5. V úvahu se berou pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií, viz 5.3.2.
5.3.6. Interpretace výsledku testu FISH:
a) Výsledky FISH testu jsou platné, pokud jsou při použití FITC filtru jasně zeleně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus a při použití rhodaminového filtru jasně červeně fluoreskující buňky pozorovány ve všech pozitivních kontrolách a nejsou pozorovány v žádných negativních kontrolách. Pokud jsou přítomné jasně fluoreskující buňky s typickou morfologií, odhadne se průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopickém poli a vypočítá počet typických buněk v 1 ml resuspendované pelety (dodatek 4). Vzorky, které obsahují alespoň
3
5 x 10
typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za pravděpodobně infikované Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Nutné je další testování. Vzorky, které obsahují méně než
3
5 x 10
typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za negativní.
b) Výsledek FISH testu je negativní, pokud při použití rhodaminového filtru nejsou pozorovány jasně červeně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, jestliže jsou tyto typické jasně červeně fluoreskující buňky při použití rhodaminového filtru pozorovány v pozitivních kontrolách.