1.5.3 Postup
1.5.3.1 Expozice testovanou látkou
Na proliferující buňky se působí testovanou látkou jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Expozice probíhá po vhodnou dobu (obvykle je účinná doba 3 - 6 hodin). Doba expozice může přesáhnout jeden nebo více buněčných cyklů.
Pro každou koncentraci se používají kultury duplicitní nebo jenom jedna. Používá-li se jenom jedna kultura, je třeba zvýšit počet koncentrací tak, aby se zajistil adekvátní počet kultur k analýze (tj. minimálně osm analyzovatelných koncentrací). Kultury s negativní kontrolou (rozpouštědlem/vehikulem) se používají duplicitní.
V případě plynných nebo těkavých látek je třeba uplatnit v testu vhodné postupy, jako je použití neprodyšně uzavřených kultivačních nádob. 5)
1.5.3.2 Hodnocení přežívání, viability a mutační frekvence
Po skončení expozice se buňky promyjí a kultivují ke stanovení přežívání a fenotypické exprese. Po expozici se obvykle začíná s analýzou cytotoxicity stanovením klonovací účinnosti - cloning efficiency nebo relativního celkového růstu.
Každý lokus má určitou minimální časový interval pro téměř optimální expresi nově indukovaných mutantů (HPRT a XPRT vyžaduje minimálně 6 - 8 dní, TK minimálně 2 dny). Buňky se pěstují v médiu s a bez selekčního činidla pro stanovení počtu mutantů a klonovací účinnosti. Po skončení doby exprese se začne s analýzou životnosti (používané k výpočtu četnosti mutantů) inokulací buněk na neselekční médium.
Pokud je látka v testu
+/-
L5178Y TK
pozitivní, je třeba minimálně na jedné z experimentálních kultur (nejvyšší pozitivní koncentrace) a na negativních a pozitivních kontrolách stanovit velikost kolonií. Pokud je látka v tomto testu negativní, změří se velikost kolonií u negativní a pozitivní kontroly. Měření se může provést i ve studiích s
+/-
TK6TK .
------------------------------------------------------------------
1) Směrnice Komise 88/302/EHS, kterou se po deváté přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování zákonů, právních předpisů a správních opatření týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 133 1988).
5) Směrnice Komise 2000/32/ES, kterou se po dvacáté šesté přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování zákonů, právních předpisů a správních opatření týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 136 2000, metoda B13/14, B.39 a B.41 jsou upraveny směrnicí Rady 2001/59/ES).
6) Směrnice Komise 2000/33/ES, kterou se po dvacáté sedmé přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 136 2000).