1.5.2 Podmínky testu
1.5.2.1 Rozpouštědlo/vehikulum
U zvoleného rozpouštědla nesmí existovat podezření, že by mohlo s testovanou látkou chemicky reagovat, a nesmí narušovat přežívání buněk a aktivitu S9.
Používá-li se méně známé rozpouštědlo musí být podpořeno referencemi prokazujícími jeho kompatibilitu. Doporučuje se, aby všude tam, kde je to možné, bylo na prvním místě zvažováno použití jako rozpouštědla vody. Je-li testovaná látka ve vodě nestálá, musí být použité organické rozpouštědlo zcela bezvodé. Voda se dá odstranit molekulárním sítem.
1.5.2.2 Koncentrace
Mezi kritéria, jež se uvažují při stanovování nejvyšší koncentrace, patří cytotoxicita, rozpustnost v systému a změny pH resp. osmolality.
Cytotoxicita se stanoví s metabolickou aktivací i bez ní v hlavním experimentu, přičemž se použije vhodné indikace buněčné integrity a růstu buněk, jako je relativní klonovací účinnost (přežití) nebo relativní celkový růst. Je vhodné stanovit cytotoxicitu a rozpustnost v předběžných experimentech.
Použijí se minimálně čtyři analyzovatelné koncentrace. Dochází-li k cytotoxicitě, musí tyto koncentrace pokrývat rozsah od maximální do nízké nebo nulové toxicity. To obvykle znamená, že se jednotlivé koncentrace nebudou lišit více než násobkem, který leží mezi hodnotami 2 a √10. Vychází-li maximální koncentrace z cytotoxicity, měla by vést k relativnímu přežití (relativní klonovací účinnosti) nebo relativnímu celkovému růstu v 10 - 20 %, ne však méně než 10 %. U relativně netoxických látek by maximální expoziční dávka měla být nejnižší z hodnot 5 mg/ml, 5 μl/ml a 0,01 M.
U relativně nerozpustných látek, jež jsou netoxické v koncentracích nižších než je koncentrace při které se již látka nerozpouští, má být nejvyšší použitá koncentrace vyšší než je mez rozpustnosti ve finálním kultivačním médiu na konci kultivace s testovanou látkou. Může být účelné vyhodnotit rozpustnost na začátku a na konci působení, jelikož se rozpustnost může během expozice v důsledku přítomnosti buněk, S9, séra atd. měnit. Nerozpustnost se dá zjistit i prostým okem. Sraženina nesmí být na překážku při hodnocení buněk.
1.5.2.3 Kontroly
V rámci každého experimentu se musejí provést i souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo, vehikulum) kontroly, a to jak s metabolickou aktivací, tak bez ní. Pokud se aplikuje metabolická aktivace, musí být pozitivní kontrola látka vyžadující metabolickou aktivaci k vyvolání mutagenního účinku. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:
+-------------+----------------+------------------------------+-----------+-----------+
| Metabolická | Lokus | Látka | CAS | EINECS |
| aktivace | | | | |
+-------------+----------------+------------------------------+-----------+-----------+
| Ne | HPRT | ethyl methansulfonát | 62-50-0 | 200-536-7 |
| | +------------------------------+-----------+-----------+
| | | ethyl nitrosomočovina | 759-73-9 | 212-072-2 |
| +----------------+------------------------------+-----------+-----------+
| | TK (malé a | methyl methansulfonát | 66-27-3 | 200-625-0 |
| | velké kolonie) | | | |
| +----------------+------------------------------+-----------+-----------+
| | XPRT | ethyl methansulfonát | 62-50-0 | 200-536-7 |
| | +------------------------------+-----------+-----------+
| | | ethyl nitrosomočovina | 759-73-9 | 212-072-2 |
+-------------+----------------+------------------------------+-----------+-----------+
| Ano | HPRT | 3-methylcholantren | 56-49-5 | 200-276-4 |
| | +------------------------------+-----------+-----------+
| | | N-nitrosodimethylamin | 62-75-9 | 200-549-8 |
| | +------------------------------+-----------+-----------+
| | | 7,12-dimethylbenzantracen | 57-97-6 | 200-359-5 |
| +----------------+------------------------------+-----------+-----------+
| | TK (malé a | Cyklofosfamid | 50-18-0 | 200-015-4 |
| | velké kolonie) | monohydrát cyklofosfamidu | 6055-19-2 | |
| +----------------+------------------------------+-----------+-----------+
| | | benzo[a]pyren | 50-32-8 | 200-028-5 |
| | +------------------------------+-----------+-----------+
| | | 3-methylcholantren | 56-49-5 | 200-276-5 |
| +----------------+------------------------------+-----------+-----------+
| | XPRT | N-nitrosodimethylamin | 62-75-9 | 200-549-8 |
| | | (pro vysoké koncentrace S-9) | | |
| | +------------------------------+-----------+-----------+
| | | benzo[a]pyren | 50-32-8 | 200-028-5 |
+-------------+----------------+------------------------------+-----------+-----------+
Pro pozitivní kontrolu se mohou použít i jiné vhodné látky; jestliže má například laboratoř historické údaje o 5-brom-2'-deoxyuridinu (CAS 59-14-3, číslo EINECS 200-415-9), lze použít i tuto referenční látku. Tam, kde je to možné, je vhodné použít pro pozitivní kontrolu látku ze stejné chemické skupiny.
Pro každý časový interval sklízení kultur je třeba použít i negativní kontrolu, ve které se používá rozpouštědlo nebo vehikulum v kultivačním médiu, zpracované stejným způsobem jako experimentální kultury. Mimoto je rovněž třeba zařadit kontrolu bez jakéhokoliv ovlivnění, ledaže existují historické údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo/vehikulum nevykazuje žádné pro buňky nepříznivé či mutagenní účinky.