Princip
Použije-li se PCR test jako hlavní screeningový test a je pozitivní, musí být jako druhý povinný screeningový test proveden IF test. Pokud se PCR test používá jako druhý screeningový test a je pozitivní, je pro dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.
Využití této metody v celém rozsahu jako hlavního screeningového testu se doporučuje jen tehdy, je-li požadována specializovaná expertíza.
Poznámka:
Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění
3 4
10 až 10
buněk Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus na 1 ml přidaných do vzorku extraktů, které byly předtím testovány s negativním výsledkem. Pro dosažení maximální citlivosti a přesnosti ve všech laboratořích mohou být vyžadovány optimalizační pokusy.
Používají se validovaná PCR činidla a protokoly. Přednostně se používá metoda s interní kontrolou.
Je třeba použít vhodná bezpečnostní opatření, aby se zabránilo kontaminaci vzorku cílovou DNA. PCR test by měli provádět zkušení laboranti v laboratořích specializovaných na molekulární biologii, aby se minimalizovala možnost kontaminace cílovou DNA.
S negativními kontrolami (u průběhu extrakce DNA a PCR) by se mělo vždy zacházet jako s konečnými vzorky, aby bylo jasné, jestli došlo k přenosu DNA.
PCR test by měl zahrnovat následující negativní kontroly:
- extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus s negativním výsledkem,
- kontroly pufru používaného pro extrakci bakterie a DNA ze vzorku,
- reakční směs PCR.
Měly by být zahrnuty následující pozitivní kontroly:
- alikvotní části resuspendovaných pelet, k nimž byl přidán Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (příprava viz dodatek 2),
- suspenze
6
10
buněk na 1 ml Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ve vodě z virulentního izolátu (např. NCPPB 2140 nebo NCPPB 4053),
- pokud možno použít při provádění PCR testu také DNA extrahovanou z pozitivních kontrolních vzorků.
Aby se zabránilo možné kontaminaci, připraví se pozitivní kontroly v odděleném prostředí od vzorků, které budou testovány.
Extrakty ze vzorků by měly být pokud možno bez zeminy. V případě použití PCR testu je potřeba připravit extrakty z umytých brambor.