6.1 Metody purifikace DNA
Použijí se výše popsané pozitivní a negativní kontrolní vzorky.
Připraví se kontrolní materiál stejným způsobem jako vzorky.
K purifikaci cílové DNA z komplexních substrátů vzorků jsou k dispozici různé metody odstraňující inhibitory PCR a jiných enzymatických reakcí a koncentrující cílovou DNA v extraktu vzorku.
Následující metoda byla optimalizována pro použití s validovanou metodou PCR, uvedenou v dodatku 6.
6.1.a) Metoda podle Pastrika (2000)
1. Napipetuje se 220 μl lýzového pufru [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] do mikrozkumavky o objemu 1,5 ml.
2. Přidá se 100 μl extraktu ze vzorku a umístí se do termobloku nebo vodní lázně o teplotě 95 °C na dobu 10 minut.
3. Mikrozkumavka se vloží na 5 minut do ledu.
4. Přidá se 80 μl zásobního roztoku lyzozymu (50 mg lyzozymu na 1 ml v 10 mM Tris HCl, pH 8,0) a inkubuje se při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.
5. Přidá se 220 μl Easy DNA® roztok A (Invitrogen), dobře se promíchá třepáním a inkubuje se při teplotě 65 °C po dobu 30 minut.
6. Přidá se 100 μl Easy DNA® roztok B (Invitrogen) a silně se promíchá třepáním, až usazenina sama poteče do mikrozkumavky a vzorek začne být stejnoměrně viskózní.
7. Přidá se 500 μl chloroformu a míchá se třepáním, až se viskozita sníží a směs se stane homogenní.
8. Odstřeďuje se na 15 000 g po dobu 20 minut při 4 °C pro oddělení fází a vytvoření mezifáze.
9. Přenese se horní fáze do čisté mikrozkumavky.
10. Přidá se 1 ml 100% etanolu (-20 °C), krátce se promíchá třepáním a inkubuje se na ledu po dobu 10 minut.
11. Odstředí se na 15 000 g po dobu 20 minut při 4 °C a odstraní se z pelety etanol.
12. Přidá se 500 μl 80% etanolu (-20 °C) a promíchá převracením mikrozkumavky.
13. Odstřeďuje se na 15 000 g po dobu 10 minut při 4°C, peleta se zachová a odstraní etanol.
14. Peleta se nechá uschnout na vzduchu nebo v DNA speed vac.
15. Peleta se resuspendujte v 100 μl sterilní vody (UPW) a nechá stát nejméně 20 minut při pokojové teplotě.
16. Skladuje se při teplotě -20 °C až do upotřebení při PCR.
17. Jakákoliv bílá usazenina se odstraní odstředěním a pro PCR se použije 5 μl supernatantu obsahujícího DNA.
6.1.b) Jiné metody
Jiné metody extrakce DNA by se mohly použít, pokud by se prokázalo, že jsou při purifikaci DNA z kontrolních vzorků obsahujících
3 4
10 až 10
patogenních buněk na 1 ml stejně efektivní.