Dodatek 3
A. Komerční standardizovaný kontrolní materiál
a) Izolované bakteriální kultury
Následující izolované bakteriální kultury se doporučují jako standardní referenční materiál buď k pozitivní kontrole (tabulka 1) nebo během optimalizace testů, aby se zabránilo vzájemnému působení (tabulka 2). Všechny kmeny jsou komerčně dostupné a lze je získat z těchto sbírek:
1. Národní sbírka patogenních bakterií rostlin (NCPPB), Ústřední vědecká laboratoř York, UK.
2. Sbírka kultur sekce ochrany rostlin (PD), Wageningen, Nizozemsko.
3. Francouzská sbírka patogenních bakterií rostlin (CFBP), Ústav fytobakteriologie INRA, Angers, Francie.
Tabulka 1: Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| Kód NCPPB | SMT | Jiné kódy | Země původu | Biovar |
| | # | | | |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 4153 | 6 | CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 | Egypt | 2 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 4154 | 10 | CFBP 4585, 550, EURS21 | Turecko | 2 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 3857 | 12 | CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 | Anglie | 2 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 1584 | 23 | CFBP 4598, EURS49 | Kypr | 2 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 2505 | 24 | CFBP 4599, EURS50 | Švédsko | 2 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 4155 | 26 | CFBP 4601, 502, EURS55 | Belgie | 2 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 4156 *) | 71 *) | PD 2762, CFBP 3857 | Nizozemsko | 2 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 4157 | 66 | LNPV 15.59 | Francie | 2 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 4158 | 39 | CFBP 4608, Port 448, EURS80 | Portugalsko | 2 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 4160 | 69 | IVIA-1632-2 | Španělsko | 2 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 4161 | 76 | B3B | Německo | 2 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 325 | 41 | CFBP 2047, KEL60-1, R842 | USA | 1 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 3967 | 42 | CFBP 4610, R285, GONg7 | Kostarika | 1 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 4028 | 43 | CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 | Kolumbie | 2 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 3985 | 44 | CFBP 4612, R578, CIP312 | Peru | 2T |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 3989 | 45 | CFBP 4613, R568, CIP226 | Brazílie | 2T |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 3996 | 46 | CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 | Peru | 3 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 3997 | 47 | CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131 | Austrálie | 3 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 4029 | 48 | CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 | Srí Lanka | 4 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 4005 | 49 | CFBP 4616, R470 | Filipíny | 4 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
| NCPPB 4011 | 50 | CFBP 4617, R288, HEmps2 | Čína | 5 |
+---------------+-------+---------------------------------------+-------------+--------+
*) Jako standardní referenční kmen se použije R. solanacearum biovar 2 (rod 3).
Poznámka:
Spolehlivost výše uvedených kmenů může být zaručena pouze v případě, že pocházejí z původních sbírek kultur.
Tabulka 2: Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií
k optimalizaci detekčních testů
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| Kód NCPPB | SMT | Jiné kódy | Identifikace |
| | # | | |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 4162 | 51 | CFBP 1954 | Bacillus polymyxa 1) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 4163 | 52 | CFBP 1538 | Pseudomonas marginalis pv. marginalis 1) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 4164 | - | CFBP 2227 | Burkholderia cepacia 2) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 4165 | - | CFBP 2459 | Ralstonia pickettii 2) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 4166 | 58 | CFBP 3567, CSL Pr1150 | Ralstonia pickettii 1) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 4167 | 60 | CFBP 4618, PD 2778 | Ralstonia sp. 1) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 1127 | 53 | CFBP 3575 | Burkholderia andropogonis 1) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 353 | 54 | CFBP 3572 | Burkholderia caryophylli 1) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 945 | 55 | CFBP 3569 | Burkholderia cepacia 1) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 3708 | 56 | CFBP 3574 | Burkholderia glumae 1) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 3590 | 57 | CFBP 3573 | Burkholderia plantarii 1) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 3726 | 59 | CFBP 3568 | Banana Blood Disease Bacterium 1), 2), 3) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 4168 | 61 | CFBP 4619, IPO S339 | Enterobacter sp. 1) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 4169 | 62 | IPO 1695 | Enterobacter sp. 1) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 4170 | 63 | CFBP 4621, IPO S306 | Ochrobactrum anthropi 1), 2) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 4171 | 64 | CFBP 4622, IPO 1693 | Curtobacterium sp. 1), 2) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 4172 | 65 | IPO 1696a | Pseudomonas sp. 1) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 4173 | - | PD 2318 | Aureobacterium sp. 2) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
| NCPPB 4174 | 81 | IVIA 1844.06 | Flavobacterium sp. 1), 2) |
+------------+-----+-----------------------+--------------------------------------------+
1) Potencionální křížově reagující kmen v sérologických testech (IF a/nebo ELISA) s polyklonálním antisérem.
2) Kmen, ze kterého lze v některých laboratořích amplifikovat produkt PCR na podobnou velikost, jako je očekávaná velikost při použití specifických primerů OLI-1 a Y-2 (viz dodatek 6).
3) Pravděpodobnost křížové reakce ve většině testů, ale výskyt znám pouze u banánů v Indonésii.
b) Komerční standardizovaný kontrolní materiál
Následující standardní kontrolní materiál je možné získat ze sbírky kultur NCPPB.
Mražené sušené pelety bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz bramboru k negativní kontrole všech testů.
Mražené sušené pelety bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz bramboru obsahující
3 4 4 6
10 až 10 a 10 až 10
buněk biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) jako pozitivní kontroly serologických a PCR testů. Protože životaschopnost buňky je ovlivněna lyofilizací, nejsou tyto vhodné jako standardy v testech izolace a testech patogenity.
Ve formaldehydu fixované suspense biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) s
6
10
buňkami na 1 ml k pozitivní kontrole sérologických testů.
B. Příprava pozitivních a negativních kontrol pro screeningové testy vodivých pletiv PCR/IF a FISH
Kultivuje se 48hodinová kultura virulentního kmene R. solanacearum rasy 3/biovaru 2 (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) na SMSA živné půdě a suspenduje se v 10 mM fosfátovém pufru, aby se získala buněčná hustota přibližně
8
2 x 10
buněk tvořících kolonie na 1 ml. Obvykle se jí dosáhne jemně zakalenou suspenzí rovnající se optické hustotě 0,15 při 600 nm.
Odebere se dřeň z pupkových konců 200 hlíz z produkce odrůdy s bílou slupkou, o které se ví, že je prosta R. solanacearum.
Zpracují se pupkové konce výše uvedeným postupem a resuspenduje se peleta v 10 ml.
Připraví se 10 sterilních mikrozkumavek o objemu 1,5 ml s 900 μl resuspendované pelety.
Přenese se 100 μl suspenze R. solanacearum do první mikrozkumavky a protřepe se.
Provede se desetinásobné ředění v dalších pěti mikrozkumavkách.
Těchto šest kontaminovaných mikrozkumavek se použije jako kontrolní vzorky. Čtyři nekontaminované mikrozkumavky se použijí jako kontrolní negativní vzorky. Mikrozkumavky musí být řádně označeny.
Připraví se alikvotní části z 100 μl ve sterilních zkumavkách o objemu 1,5 ml, čímž se získá 9 kopií každého kontrolního vzorku. Uskladní se při teplotě -16 až -24 °C až do doby použití.
Přítomnost a množství R. solanacearum v kontrolních vzorcích by měly být nejprve potvrzeny testem IF.
Pro PCR test se provede extrakce DNA z pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.
Pro IF a FISH testy se provede test patogenity pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.
Při kvantitativních rozborech IF, FISH a PCR musí být R. solanacearum zjištěna v nejméně v
6 4
10 a 10
buněk/ml pozitivních kontrol a nesmí být zjištěn v žádné z negativních kontrol.