Dodatek 2
Média pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
a) Živné půdy pro izolaci a kultivaci
Živný agar (NA)
Živný agar (Difco) 23,0 g
Destilovaná voda 1,00 l
Rozpustí se složky a sterilují tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.
Kvasnično-pepton-glukózový agar (YPGA)
Kvasnicový extrakt (Difco) 5,0 g
Bacto-Pepton (Difco) 5,0 g
D(+) Glukóza (monohydrát) 10,0 g
Bacto-Agar (Difco) 15,0 g
Destilovaná voda 1,00 l
Rozpustí se složky a sterilují tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.
Sacharózopeptonový agar (SPA)
Sacharóza 20,0 g
Bacto-Peptone (Difco) 5,0 g
K HPO 0,5 g
2 4
MgSO . 7 H O 0,25 g
4 2
Bacto-Agar (Difco) 15,0 g
Destilovaná voda 1,00 l
pH 7,2 - 7,4
Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.
Kelmanovo tetrazoliové médium
kasein hydrolyzát (Difco) 1,0 g
Bacto-Pepton (Difco) 10,0 g
Dextróza 5,0 g
Bacto-Agar (Difco) 15,0 g
Destilovaná voda 1,00 l
Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.
Ochladí se na 50 °C a přidá se filtrem sterilizovaný roztok 2,3,5-trifenyl-tetrazoliumchloridu (Sigma), až do dosažení konečné koncentrace 50 mg na litr.
b) Validované selektivní živné půdy
Živná půda SMSA (Englebrecht, 1994 ve znění Elphinstone et al., 1996)
Základní živná půda
Casamino kyseliny (Difco) 1,0 g
Bacto-Pepton (Difco) 10,0 g
Glycerol 5,0 ml
Bacto-Agar (Difco)
(viz pozn. 2) 15,0 g
Destilovaná voda 1,00 l
Rozpustí se složky a sterilují v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.
Ochladí se na 50 °C a přidá filtrem sterilizovaný vodný roztok následujících složek, aby se získala stanovená konečná koncentrace:
Krystalová violeť (Sigma) 5 mg/l
Polymixin-B-sulfát
(Sigma P1004) 600 000 U (přibližně 100 mg)/l
Bacitracin (Sigma B-0125) 1 250 U (přibližně 25 mg)/l
Chloramfenikol (Sigma C-3175) 5 mg/l
Penicilín-G (Sigma P-3032) 825 U (přibližně 0,5 mg)/l
2,3,5-trifenyltetrazolium
chlorid (Sigma) 50 mg/l
Poznámky:
1. Použití jiných než výše uvedených reagencí může ovlivnit růst R. solanacearum.
2. Místo Bacto-Agar (Difco) může být použit Oxoid Agar #1. V takovém případě bude růst R. solanacearum pomalejší, ale může to také omezit růst konkurenčních saprofytů. Typické kolonie R. solanacearum se mohou tvořit o 1 - 2 dny déle a červené zbarvení může být světlejší a rozptýlenější než při použití Bacto-Agaru.
3. Zvýšení koncentrace bacitracinu na 2 500 U/l může omezit populace konkurenčních bakterií bez ovlivnění růstu Ralstonia solanacearum.
Roztoky antibiotik se uchovávají a skladují při teplotě 4 °C v temnu a musí se spotřebovat do 1 měsíce.
Misky s médiem by měly být před použitím zbaveny povrchové kondenzace.
Nutno zabránit přílišnému vysušení média.
Každá nově připravená šarže živné půdy by měla být podrobena kontrole kvality živné půdy roztěrem suspense referenční kultury R. solanacearum na médium (viz dodatek 3) a pozorováním, zda se po 2 až 5 dnech při teplotě 28 °C objeví typické kolonie.
c) Validované obohacené živné půdy
Živná půda SMSA (Elphinstone et al., 1996)
Provede se příprava jako pro selektivní agarovou živnou půdu SMSA, ale vynechá se Bacto-Agar a 2,3,5-trifenyltetrazolium chlorid.
Upravená živná půda Wilbrink (Caruso et al., 2002)
Sacharóza 10 g
Proteázový pepton 5 g
K HPO 0,5 g
2 4
MgSO 0,25 g
4
NaNO 0,25 g
3
Destilovaná voda 1,00 l
Steriluje se tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut a ochladí se na 50 °C.
Přidá se antibiotický zásobní roztok jako pro živnou půdu SMSA.