7. Test na lilku vejcoplodém
Poznámka:
Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění
3 4
10 až 10
jednotek Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus tvořících kolonie na 1 ml přidaný k extraktům ze vzorku, které byly testovány s negativním (příprava viz. dodatek 2)
Nejvyšší citlivost zjištění lze očekávat při použití čerstvě připraveného extraktu ze vzorku a optimálních růstových podmínkách. Metodu však lze úspěšně použít i na extrakty, které byly uchovávány v glycerolu při teplotě -68 až -86 °C.
Některé odrůdy lilku vejcoplodého poskytují vynikající selektivní obohacující médium pro růst Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus dokonce v případě nepřítomnosti příznaků a poskytují také vynikající základní konfirmační test.
Pro omezení nebezpečí falešně negativních výsledků by měly být vytvořeny optimální růstové podmínky.
Podrobnosti o pěstování jsou uvedeny v Dodatku 8.
7.1. Peleta podle 3.1.5. se rozdělí mezi rostliny lilku jednou z níže uvedených metod (7.2, 7.3, 7.4). Používají se pouze rostliny ve fázi 2 - 3 listů do úplného rozvinutí třetího pravého listu. Aby se zajistilo úplné využití resuspendované pelety i efektivní inokulaci, bude pro níže uvedené postupy potřeba 15 - 25 lilků na vzorek.
7.2. Inokulace zářezem I
7.2.1. Každý květináč se horizontálně podepře (pro květináče o průměru 10 cm je vhodný blok pěnového polystyrénu s vyhloubenou částí o rozměrech 5 cm hloubky, 10 cm šířky a 15 cm délky). Pro každý testovaný vzorek se mezi stonek a blok umístí proužek sterilní hliníkové fólie. Rostlinu je možno fixovat na místě gumovým páskem kolem bloku.
7.2.2. Pomocí skalpelu se provede mezi děložními lístky a prvním pravým listem podélný nebo mírně úhlopříčný řez dlouhý 0,5 až 1,0 cm a hluboký přibližně jako tři čtvrtiny průměru stonku.
7.2.3. Zářez se přidrží otevřený pomocí špičky čepele skalpelu a nanese se do něj inokulum štětečkem na oční linky nebo jemným malířským štětečkem namočeným do pelety. Zbytek pelety se rozdělí mezi všechny testovací rostliny lilku.
7.2.4. Řez se překryje sterilní vazelínou aplikovanou injekční stříkačkou o objemu 2 ml.
7.3 Inokulace zářezem II
7.3.1. Na stonek rostliny držené dvěma prsty se napipetuje mezi děložní lístky a první pravý list kapka (přibližně 5 až 10 μl) suspendované pelety.
7.3.2. Pomocí sterilního skalpelu se udělá sešikmený zářez (v úhlu přibližně 5°), dlouhý 1,0 cm a hluboký přibližně jako 2/3 tloušťky stonku, přičemž s řezem se začne v místě kapky suspendované pelety.
7.3.3. Řez se zakryje sterilní vazelínou z injekční stříkačky.
7.4. Inokulace injekční stříkačkou
7.4.1 Pro snížení vnitřního napětí buněk (turgoru) se rostliny lilku den před inokulací nezalévají.
7.4.2 Stonky lilku vejcoplodého se inokulují těsně nad děložními lístky pomocí injekční stříkačky s podkožní jehlou (ne méně než 23 G). Peleta se rozdělí mezi testovací rostliny lilku vejcoplodého.
7.5. Jako pozitivní kontrola se inokuluje 5 rostlin stejnou inokulační metodou (7.2, 7.3 nebo 7.4) vodní suspenzí
5 6
10 až 10
buněk na 1 ml známé kultury původce kroužkovitosti a kde je to možné i pletivem z přirozeně infikovaných hlíz bramboru.
7.6. Jako negativní kontrola se inokuluje 5 rostlin sterilním 0,05 M PBS stejnou inokulační metodou (7.2, 7.3 nebo 7.4).
7.7. Po inokulaci se rostliny nechají inkubovat v karanténě ve vhodných podmínkách (dodatek 8) po dobu až 4 týdnů při teplotě 18 - 24 °C. Rostliny se inkubují za dostatečného osvětlení a vysoké vlhkosti (70 - 80 %) a zalévají se tak, aby nedošlo k nasávání vody nebo vadnutí kvůli nedostatku vody. Buňky Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus odumírají při teplotách nad 30 °C a optimální teplota je 21 °C. Aby se zamezilo kontaminaci, inkubují se rostliny pro pozitivní a negativní kontroly ve skleníku nebo růstové komoře na jasně oddělených policích, anebo při nedostatku místa se zajistí přísné oddělení mezi zacházení s nimi. Pokud musí být rostliny pro různé vzorky inkubovány blízko sebe, oddělí se vhodnými přepážkami. Při hnojení, zalévání, kontrole a jiné manipulaci se věnuje maximální pozornost tomu, aby nedošlo ke kontaminaci. Je nezbytné, aby skleníky i růstové komory byly chráněny před veškerým hmyzem, protože by mohl přenášet bakterie z jednoho vzorku na druhý.
7.8. Pravidelně po osmi dnech se spočítají rostliny vykazující příznaky. Původce kroužkovitosti působí u lilku vejcoplodého vadnutí listů, které může začít jako okrajová nebo mezižilková ochablost (ztráta turgoru). Zvadlé pletivo může zprvu být tmavozelené nebo strakaté, ale před znekrotizováním zesvětlí. Povadlá místa mezi žilnatinou mívají často mastně vodnatý vzhled. Nekrotická pletiva mívají často jasně žlutý okraj. Rostliny vždy neodumírají; čím déle trvá období do objevení se příznaků, tím je větší naděje na přežití. Rostliny mohou infekci odrůst. Mladé rostliny lilku vejcoplodého jsou mnohem citlivější vůči nízkým koncentracím původce kroužkovitosti než starší rostliny, proto je nezbytné používat rostliny ve fázi tří listů a nebo krátce před ní. Vadnutí mohou také způsobovat populace jiných bakterií nebo hub přítomných v peletě z pletiv hlízy. Patří k nim Erwinia carotovora subsp. carotovora a E. carotovora subsp. atroseptica, Phoma exigua var. foveata, jakož i velké koncentrace saprofytických bakterií. Tyto případy vadnutí lze odlišit od případů způsobených původcem kroužkovitosti, jelikož rychle vadnou celé listy nebo celé rostliny. Může se také připravit Gramovo barvení: tento test rozliší Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus od Erwinia spp.
7.9. Jakmile se na lilku vejcoplodém objeví příznaky, měla by být provedena izolace za použití částí pletiva zvadlých listů nebo stonků rostlin. Povrch listů a stonků lilku vejcoplodého se vydezinfikuje otřením 70% etanolem. Provede se test IF nebo PCR na šťávě z lilku a izoluje se na vhodném (selektivním) médiu (viz oddíl 8). Může se také připravit Gramovo barvení (dodatek 9). Čisté kultury podezřelé z přítomnosti Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se identifikují a potvrdí se patogenita (viz oddíl 9 a 10).
7.10. Za určitých okolností, zejména pokud nejsou růstové podmínky optimální, se může stát, že Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus zůstává v rostlinách lilku vejcoplodého jako latentní infekce dokonce i po uplynutí inkubační doby až 4 týdnů. Pokud nejsou po 4 týdnech pozorovány žádné příznaky, provede se test IF/PCR na složeném vzorku částí stonků o délce 1 cm z každé testované rostliny odebraných nad místem inokulace. Pokud je test pozitivní, měla by být provedena izolace na vhodných (selektivních) médiích postupem podle oddílu 8. Čisté kultury podezřelé z přítomnosti Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus se identifikují a potvrdí se patogenita (viz oddíl 9 a 10).