6.3. Analýza produktu PCR
6.3.1. Rozdělí se amplikony PCR elektroforézou v agarózovém gelu. Nanese se nejméně 12 μl amplifikované reakční směsi DNA z každého vzorku smíchané s 3 μl nanášecího pufru (dodatek 6) do 2,0% (w/v) agarózového gelu v Trisacetát - EDTA (TAE) pufru (dodatek 6) při 5 - 8 V na cm. Použije se vhodný marker DNA, např. 100 bp ladder.
6.3.2. Detekují se proužky DNA barvením v ethidium bromidu (0,5 mg na l) po dobu 30 - 45 minut, za použití vhodných bezpečnostních opatření pro zacházení s tímto mutagenem.
6.3.3. V obarveném a UV (krátké vlnové délky, např. 302 nm) prosvíceném gelu se hledají amplifikované produkty PCR o očekávané velikosti a výsledek se zdokumentuje.
6.3.4. U všech nových nálezů se zkontroluje pravost amplikonu PCR provedením restrikční enzymové analýzy ve zbývajícím vzorku amplifikované DNA inkubací při optimální teplotě a době s vhodným restrikčním enzymem a pufrem (viz dodatek 6). Rozdělí se naštěpené fragmenty elektroforézou v agarózovém gelu a pozoruje se charakteristický vzor restrikčního fragmentu pod UV prosvícením po obarvení ethidiumbromidem a porovnává se s neštěpenou a štěpenou pozitivní kontrolou.
Interpretace výsledku PCR testu:
PCR test je negativní, pokud amplikon typický pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus očekávané velikosti nebyl zjištěn v daném vzorku, ale byl zjištěn ve všech pozitivních kontrolních vzorcích (v případě vícenásobné PCR s rostlinnými interními kontrolními primery: druhý produkt PCR očekávané velikosti musí být amplifikován s daným vzorkem).
PCR test je pozitivní, pokud byl zjištěn amplikon typický pro Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus očekávané velikosti a vzoru (pokud se požaduje), za předpokladu, že nebyl amplifikován žádným z negativních kontrolních vzorků. Spolehlivého potvrzení pozitivního výsledku lze dosáhnout také opakováním testu s druhou sadou PCR primerů (oddíl 9.3).
Poznámka:
Lze mít podezření na inhibici PCR, pokud byl očekávaný amplikon získán z pozitivního kontrolního vzorku obsahujícího Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ve vodě, ale z pozitivní kontroly s Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus v bramborovém extraktu byly negativní. Ve vícenásobných protokolech PCR s interními kontrolami PCR i inhibici reakce došlo, pokud nebyl získán žádný z obou amplikonů.
Lze mít podezření na kontaminaci, pokud byl očekávaný amplikon získán z jedné nebo více negativních zkoušek.