6.2. Identifikační testy
Identifikují se čisté kultury izolovaného podezřelého organismu R. solanacearum použitím nejméně dvou následujících testů založených na různých biologických principech.
Zahrnou se případně známé referenční kmeny pro každý provedený test (viz dodatek 3).
6.2.1. Výživové a enzymatické identifikační testy
Určují se následující fenotypové vlastnosti, které jsou vesměs přítomny nebo naopak chybí u R. solanacearum, metodami Lelliott a Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001).
Text Očekávaný výsledek
Produkce fluorescenčního pigmentu -
Inkluze PHB +
Oxidačně fermentační test O+/F-
Katalázová aktivita +
Oxidázový test podle Kovacse +
Redukce dusičnanů +
Využití citrátů +
Růst při 40 °C -
Růst v 1% NaCl +
Růst v 2% NaCl -
Arginin-dihydrolázová aktivita -
Ztekucení želatiny -
Hydrolýza škrobu -
Hydrolýza eskulinu -
Produkce levanu -
Média a metody viz. Lelliot & Stead (1987).
6.2.2. Test IF
6.2.2.1. Připraví se suspenze přibližně
6
10
buněk na 1 ml v pufru IF (dodatek 4).
6.2.2.2. Připraví se řada dvojnásobných zředění vhodného antiséra.
6.2.2.3. Použije se IF metoda (6.1.5.).
6.2.2.4. Test IF je pozitivní, jestliže titr IF kultury odpovídá titru pozitivní kontroly.
6.2.3. Test ELISA
Poznámka:
Při provádění pouze 2 identifikačních testů se nepoužívá kromě této metody jiný sérologický test.
6.2.3.1. Připraví se suspenze přibližně
8
10
buněk na 1 ml v 1X PBS (dodatek 4).
6.2.3.2. Provede se test ELISA se specifickou monoklonální protilátkou k R. solanacearum.
6.2.3.3. Test ELISA je pozitivní, jestliže hodnota jeho výsledku získaná z této kultury je nejméně poloviční v porovnání s hodnotou z pozitivní kontroly.
6.2.4. Testy PCR
6.2.4.1. Připraví se suspenze přibližně
6
10
buněk na 1 ml sterilní vody (UPW = ultra pure water).
6.2.4.2. Ohřeje se 100 μl buněčné suspense v uzavřených zkumavkách v ohřívacím bloku nebo vařící vodní lázni při 100 °C 4 minuty. Vzorky mohou být uchovány při teplotě -16 až -24 °C do dalšího použití.
6.2.4.3. Použijí se příslušné postupy PCR k amplifikaci amplikonů specifických pro R. solanacearum (např. Seal et al. (1993); Pastrik a Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999).
6.2.4.4. Identifikace organismu R. solanacearum je pozitivní, jestliže amplikony PCR mají stejnou velikost a mají stejnou mnohotvárnost délky fragmentů jako pozitivní kontrolní kmen.
6.2.5. Test FISH
6.2.5.1. Připraví se suspenze přibližně
6
10
buněk na 1 ml v UPW.
6.2.5.2. Použije se metoda FISH (6.1.7) s nejméně 2 oligosondami specifickými pro R. solanacearum (dodatek 7).
6.2.5.3. Test FISH je pozitivní, jestliže se u kultury a pozitivní kontroly dosáhne stejných reakcí.
6.2.6. Analýza mastných kyselin (FAP)
6.2.6.1. Pěstuje se kultura na tryptikázo-sójovém agaru (Oxoid) 48 hodin při teplotě 28 °C.
6.2.6.2. Použijte se metoda FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).
6.2.6.3. Test FAP je pozitivní, jestliže je profil podezřelé kultury stejný jako profil pozitivní kontroly. Výskyt charakteristických mastných kyselin: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH a 18:1 2OH a absence 16:0 3 OH poukazuje na Ralstonia sp.
6.2.7. Metody charakteristiky kmenů
Pro každý nový případ izolace R. solanacearum se doporučuje charakteristika kmenu použitím jedné z následujících metod.
U každého provedeného testu se zahrnou případně známé referenční kmeny (viz. dodatek 3).
6.2.7.1. Stanovení biovaru
R. solanacearum tvoří biovary lišící se schopností využití a/nebo oxidace tří disacharidů a tří hexosových alkoholů (Hayward, 1964 a Hayward et al., 1990). Živná půda pro test biovaru je popsána v dodatku 2. Test lze úspěšně provést očkováním do živné půdy s čistou kulturou R. solanacearum a inkubací při teplotě 28 °C. Je-li živná půda rozdělena na sterilní destičky s 96 jamkami (200 μl na 1 jamku), zbarvení se mění během 72 hodin od olivově zelené po žlutou a znamená pozitivní výsledek testu.
-------------------------------------------------------------
Biovar
------------------------------------------
1 2 3 4 6
-------------------------------------------------------------
Využití:
Makosa - + + - +
Laktosa - + + - +
D (+) Cellobiosa - + + - +
Mannitol - - + + +
Sorbitol - - + + -
Dulcitol - - + + -
-------------------------------------------------------------
Dodatečné testy pro rozlišení dílčích fenotypů biovaru 2
-------------------------------------------------------------
Biovar 2A Biovar 2A Biovar 2T
(světově (Chile a (tropické
rozšířen) Kolumbie) oblasti
-------------------------------------------------------------
Využití trehalosy - + +
Využití meso-inositolu + - +
Využití D ribosy - - +
Pektolytická aktivita 1) nízká nízká vysoká
-------------------------------------------------------------
1) Viz Lelliott a Stead (1987).
6.2.7.2. Genomická variabilita
Molekulární identifikace kmenů komplexu R. solanacearum lze dosáhnout několikerými technikami, mezi něž patří:
1. Analýza délkového polymorfismu restrikčních fragmentů RFLP (Cook et al., 1989).
2. Repetitivní sekvenční PCR s využitím primerů REP, BOX a ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).
3. Analýza délkového polymorfismu amplifikovaných fragmentů AFLP (Van der Wolf et al., 1998).
6.2.7.3. Metody PCR
Specifické primery PCR (Pastrik et al, 2002; viz dodatek 6) lze použít k diferenciaci kmenů patřících do skupiny 1 (biovary 3, 4 a 5) a skupiny 2 (biovary 1, 2A a 2T) R. solanacearum, jak bylo původně definováno analýzou RFLP (Cook et al., 1989) a sekvenováním 16S rDNA (Taghavi et al., 1996).