6.1. Diagnostické a detekční testy
6.1.1. Test na výtok slizu ze stonku
Přítomnost R. solanacearum ve stoncích vadnoucích rostlin bramboru, rajčete nebo jiných hostitelských rostlin může ukázat následující jednoduchý test pravděpodobného výskytu: uřízne se stonek právě nad úrovní země. Řez stonku se ponoří do zkumavky s čistou vodou. Sleduje, se, zda se po několika minutách objeví charakteristická samovolně proudící vlákna bakteriálního slizu z přeříznutých cévních svazků.
6.1.2. Test na přítomnost granulí poly-β-hydroxybutyrátu
1. Připraví se roztěr bakteriálního slizu z infikovaného pletiva nebo ze 48 hodinové kultury na živné půdě YPGA nebo SPA (dodatek 2) na mikroskopické sklíčko.
2. Připraví se pozitivní kontrolní roztěr kmenu biovaru 2 R. solanacearum a případně negativní kontrolní roztěr o známém PHB negativním sp.
3. Roztěry se nechají uschnout a spodní povrch každého sklíčka se rychle protáhne nad plamenem, aby se roztěry fixovaly.
4. Preparáty se obarví buď nilskou modří nebo súdánskou černí a provede se mikroskopické pozorování podle níže uvedeného popisu:
Test nilskou modří:
a) Obě sklíčka se zakápnou 1% vodným roztokem nilské modři a nechají se inkubovat 10 minut při teplotě 55 °C.
b) Odstraní se barvící roztok. Krátce se opláchne jemně tekoucí vodou z kohoutku. Přebytečná voda se odsaje savým papírem.
c) Roztěr se zakápne 8% vodním roztokem kyseliny octové a nechá se inkubovat 1 minutu při pokojové teplotě.
d) Krátce se opláchne jemně tekoucí vodou z kohoutku. Přebytečná voda se odsaje savým papírem.
e) Znovu se navlhčí kapkou vody a přiloží se krycí sklíčko.
f) Zkoumá se obarvený roztěr epifluorescenčním mikroskopem při 450 nm pod olejovou nebo vodní imersí se zvětšením 600 x až 1000 x s použitím objektivu pro olejovou nebo vodní imersi.
g) Pozoruje se, zda se objeví na PHB granulích jasně oranžová fluorescence. Také se pozoruje v procházejícím normálním světle, zda jsou granule intracelulární a zda je morfologie buněk typická pro R. solanacearum.
Test súdánskou černí:
a) Zakápnou se všechna sklíčka 0,3% roztokem súdánské černi B v 70% etanolu a inkubují se 10 minut při pokojové teplotě.
b) Odstraní se barvící roztok a krátce se opláchne jemně tekoucí vodou z kohoutku a odsaje se přebytečná voda savým papírem.
c) Sklíčka se ponoří krátce do xylolu a vysají se savým papírem. Upozornění: Xylol je zdraví škodlivý, je třeba dodržet nezbytná bezpečnostní opatření a pracovat v digestoři.
d) Sklíčka se zakápnou 0,5 % (w/v) vodným roztokem safraninu a nechají 10 vteřin inkubovat při pokojové teplotě. Upozornění: safranin je zdraví škodlivý, je třeba dodržet nezbytná bezpečnostní opatření a pracovat v digestoři.
e) Sklíčka se opláchnou jemně tekoucí vodou z kohoutku, odsaje se přebytečná voda savým papírem a přiloží se krycí sklíčko.
f) Zkoumá se obarvený roztěr mikroskopem s procházejícím světlem pod olejovou imersí a při zvětšení 1 000x.
g) Hledá se modročerné zbarvení PHB granulí v buňkách R. solanacearum s růžově zbarvenými stěnami buněk.
6.1.3. Sérologické aglutinační testy
Aglutinace buněk R. solanacearum v bakteriálním slizu nebo v extraktech z pletiv s příznaky je nejlépe pozorovatelná pomocí validovaných protilátek (viz. dodatek 3) označených příslušnými obarvenými značkovači, např. červenými buňkami Staphylococcus aureus nebo obarvenými latexovými částicemi. Při použití komerčně dostupného vybavení (viz. dodatek 3) se postupuje podle instrukcí výrobce. Jinak je postup následující:
a) Smíchají se kapky suspenze označené protilátky a bakteriálního slizu (přibližně 5 μl každé látky) na okénku testovacího víceokénkového sklíčka.
b) Připraví se pozitivní a negativní kontrolní vzorky použitím suspenzí biovaru 2 R. solanacearum a heterologního kmenu.
c) Pozoruje, se zda se v pozitivních vzorcích po jemném míchání po dobu 15 sekund objeví aglutinace.
6.1.4. Selektivní izolace
6.1.4.1. Očkování na živnou půdu
Poznámka:
Než se použije tato metoda poprvé, provede se předběžný test k zajištění reprodukovatelné detekce
3 4
10 až 10
jednotek tvořících kolonie R. solanacearum na 1 ml přidaných do extraktů ze vzorků, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.
Použije se řádně validovaná selektivní živná půda, např. SMSA (ve znění Elphinstone et al., 1996; viz. dodatek 2).
Rozlišení R. solanacearum od jiných bakterií schopných na živné půdě růst vyžaduje velkou pozornost. Dále, kolonie R. solanacearum mohou mít atypickou morfologii, jestliže Petriho misky jsou přeplněny nebo jsou rovněž přítomny antagonistické bakterie. Je-li podezření na konkurenci nebo inhibici, měl by být vzorek otestován znovu pomocí jiného testu.
Při použití čerstvě připravených extraktů ze vzorků lez očekávat, že citlivost detekce touto metodou bude velmi vysoká. Metoda je však použitelná i pro extrakty, které byly uchovány v glycerolu při teplotě od -68 do -86 °C.
Pozitivní kontroly se připraví jako desetinné ředění ze suspenze
6
10 cfu/ml
virulentního kmene biovaru 2 R. solanacearum (např. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). K vyloučení možné kontaminace se připraví pozitivní kontrolní vzorky zcela odděleně od vzorků k testování.
U každé nově připravené šarže selektivní živné půdy by měla být před jejím použitím k rutinnímu testování vzorků nejdříve otestována její vhodnost pro kultivaci patogenu. Kontrolní materiál se testuje týmž způsobem jako vzorek (vzorky).
1. Provede se ředění s cílem zajistit, aby všechny populace saprofytických bakterií byly vyloučeny. Nanese se 50 - 100 μl extraktu vzorku na 1 misku pro každé ředění.
2. Misky se nechají inkubovat při teplotě 28 °C. Po 48 hodinách se zkontroluje jejich stav a pak se provádí kontrola denně po 6 dní. Typické kolonie R. solanacearum na živné půdě SMSA jsou mléčně bílé, ploché, nepravidelné a fluidní a po 3 dnech inkubace se rozvine růžově až krvavě červené zbarvení ve středu s vnitřními pruhy nebo spirálami.
Poznámka:
Někdy se na tomto médiu tvoří atypické kolonie R. solanacearum. Mohou být malé, kruhové, zcela červené a nefluidní nebo jen částečně fluidní, a proto obtížně rozeznatelné od saprofytických bakterií tvořících kolonie.
3. Předpokládané kolonie R. solanacearum se rozetřou nebo očkují metodou zřeďování na universální živnou půdu, aby se získaly izolované kolonie (viz. dodatek 2).
4. Kultury se uchovávají krátkodobě ve sterilní vodě (pH 6 - 8, bez chlóru) při pokojové teplotě v temnu nebo dlouhodobě ve vhodném ochranném médiu při teplotě -68 až -86 °C nebo lyofilizované.
5. Provede se identifikace podezřelých kultur (viz. oddíl 6.2.) a test patogenity (viz oddíl 6.3).
Interpretace výsledků testu očkováním na selektivní média.
Test očkování na selektivní média je negativní, jestliže po 6 dnech nejsou zpozorovány žádné bakterie nebo nejsou nalezeny žádné podezřelé kolonie typické pro R. solanacearum, za předpokladu, že nedošlo k inhibici jinými bakteriemi a v kontrolních vzorcích jsou nalezeny typické kolonie R. solanacearum.
Test očkování na selektivní média je pozitivní, jestliže jsou izolovány podezřelé kolonie R. solanacearum.
6.1.4.2. Obohacovací testy
Použije se validované médium pro obohacení, např. modifikovaný bujón Wilbrink (viz dodatek 2).
Tento postup lze použít pro selektivní zvětšení populací R. solanacearum v extraktech ze vzorků a zvýšení citlivosti detekce. Tímto způsobem dojde i ke zředění potenciálních inhibitorů PCR testu (1:100). Obohacení R. solanacearum však může být neúspěšné z důvodů konkurence nebo antagonismu saprofytických organismů, které bývají často současně také obohaceny. Z tohoto důvodu může být izolace R. solanacearum z obohacené kultury obtížná. Kromě toho, protože může dojít k rozvoji populací sérologicky příbuzných saprofytů, se pro test ELISA doporučuje použít místo polyklonálních protilátek specifické monoklonální protilátky.
1. U obohacovacího testu PCR se přenese 100 ul extraktu ze vzorku do 10 ml obohaceného bujónu (dodatek 2), který se předem připraví do sterilních zkumavek nebo baněk. U obohacovacího testu ELISA může být použit větší podíl extraktu ze vzorku do bujónu (např. 100 ul v 1,0 ml obohacené živné půdy).
2. Inkubuje se 72 hodin při teplotě 27 až 30 °C v třepané nebo statické kultuře s uvolněnými uzávěry, které umožní provzdušňování.
3. Před zahájením testů ELISA nebo PCR se obsah dobře promíchá.
4. S obohaceným bujónem se zachází týmž způsobem jako se vzorky ve výše uvedených testech.
Poznámka:
Očekává-li se inhibice obohacení R. solanacearum z důvodu vysoké koncentrace konkurenčních saprofytických bakterií, lze docílit lepších výsledků obohacením extraktů ze vzorků před jakýmkoli odstřeďováním nebo jinými postupy zvyšování koncentrace.
6.1.5. Test IF
Postup
Použití testu IF jako hlavního screeningového testu se doporučuje kvůli dokázané spolehlivosti v dosažení požadovaných prahů.
Použije-li se test IF jako hlavní a výsledek IF testu je pozitivní, musí být jako druhý screeningový test použit test izolace, PCR nebo FISH. Jestliže je test IF použit jako druhý screeningový test a je pozitivní, je nutné provést další testování podle postupového diagramu, aby byla analýza úplná.
Poznámka:
Použije se validovaný zdroj protilátek R. solanacearum. Doporučuje se určit titr pro každou novou šarži protilátek. Titr je definován jako nejvyšší ředění, při kterém dojde k optimální reakci při testování suspenze obsahující
5 6
10 až 10
buněk/ml homologického kmene R. solanacearum a použitím vhodného konjugátu fluorescenčního isothiokyanatanu (FITC) podle doporučení výrobce. Validovaná polyklonální antiséra mají všechna titr IF nejméně 1:2 000. Během testování by měly být použity protilátky v pracovních ředěních blízkých nebo stejných jako titr.
Test by měl být proveden na čerstvě připravených extraktech ze vzorků. Jestliže je to nutné, může být úspěšně proveden na vzorcích uchovaných při teplotě -68 až -86 °C v glycerolu. Glycerol může být ze vzorku odstraněn přidáním 1 ml pufru (dodatek 4), 15minutovým odstřeďováním při 7 000 g a resuspenzí ve stejném množství peletového pufru. Často to není potřeba, zvláště pokud jsou vzorky fixovány na sklíčka plamenem.
Připraví se oddělená pozitivní kontrolní sklíčka s homologickým kmenem nebo jiným referenčním kmenem R. solanacearum suspendovaným v bramborovém extraktu, jak je uvedeno v dodatku 3 B, a nepovinně v pufru.
Pletivo infikované přirozenou cestou (uchovávané lyofilizací nebo zmrazením při teplotě -16 až 24 °C) by se mělo podle možností použít jako paralelní kontrola na stejném podložním sklíčku.
Jako negativní kontroly se použijí alikvotní díly extraktů ze vzorků, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.
Standardizované materiály k pozitivní a negativní kontrole, které lze použít pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3.
Použijí se mikroskopická sklíčka s více okénky, pokud možno s 10 okénky s průměrem nejméně 6 mm.
Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorků.
6.1.5.1. Připraví se sklíčka k testování jedním z následujících postupů:
i) Pro pelety s relativně nízkým množstvím sedimentu škrobu:
Napipetuje se odměřené standardní množství (15 μl je vhodné pro průměr okénka 6 mm - u většího okénka je množství větší v příslušném poměru) resuspendované bramborové pelety v ředění 1/100 do prvního okénka.
Následně se napipetuje stejné množství nezředěné pelety (1/1) do zbývajících okének v řadě. Druhá řada může být použita jako duplikát nebo pro druhý vzorek, jak ukazuje obr. 1.
ii) Pro jiné pelety:
Připraví se desetinná ředění (1/10, 1/100) resuspendované pelety v peletovém pufru. Napipetuje se odměřené standardní množství (15 μl je vhodné pro průměr okénka 6 mm - u většího okénka je množství větší v příslušném poměru) resuspendované pelety pro každé ředění do řady okének. Druhá řada může být použita jako rezervní nebo pro druhý vzorek, jak ukazuje obr. 2.
6.1.5.2. Vysuší se kapičky při okolní teplotě nebo zahřátím na teplotu 40 až 45 °C. Bakteriální buňky se fixují na sklíčko buď zahřátím (15 minut při teplotě 60 °C), plamenem, 95% etanolem nebo podle konkrétních instrukcí od dodavatele protilátek.
Pokud je potřeba, fixovaná sklíčka je možné skladovat ve zmrazeném stavu v suchém boxu po nezbytně krátkou dobu (maximálně 3 měsíce) před dalším testováním.
6.1.5.3. Postup IF
i) Podle přípravy sklíčka na test v odst. 5.1.i):
Připraví se sada dvojnásobných zředění. První jamka by měla mít 1/2 titru (T/2), ostatní 1/4 titru (T/4), 1/2 titru (T/2), titr (T) a dvojnásobek titru (2T).
ii) Podle přípravy sklíčka na test v odst. 5.1.ii):
Připraví se pracovní ředění (PŘ) protilátek v pufru IF. Pracovní ředění ovlivňuje přesnost.
Obrázek 1
Obrázek 1. Příprava sklíčka na test podle odst. 6.1.5.1.i) a 6.1.5.3.i)
Obrázek 2
Obrázek 2. Příprava sklíčka na test podle odst. 6.1.5.1.ii) a 6.1.5.3.ii)
1. Podložní sklíčka se uspořádají na navlhčený savý papír. Každé testovací okénko se pokryje kompletně ředěním protilátek. Množství protilátky na každém okénku musí být nejméně stejné jako množství použitého extraktu.
Pokud nejsou k dispozici konkrétní pokyny od dodavatele protilátek, postupuje se následovně:
2. Podložní sklíčka se inkubují na vlhkém papíře přikrytá po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18 - 25 °C).
3. Setřesou se kapky ze všech podložních sklíček a tato se pečlivě opláchnou pufrem IF. Umyjí se ponořením po dobu 5 minut v pufru IF Tween (dodatek 4) a následně v pufru IF. Je třeba zabránit vzniku aerosolu nebo přenosu kapiček, které by mohly způsobit vzájemnou kontaminaci. Pečlivě se odstraní přebytečná vlhkost jemným osušením.
4. Sklíčka se umístí na vlhký papír. Testovací okénka se pokryjí ředěním konjugátu FITC, kterým se stanovuje titr. Množství konjugátu naneseného do okének musí být stejné jako množství použité protilátky.
5. Sklíčka se inkubují zakrytá na vlhkém papíru po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18 - 25 °C).
6. Setřesou se kapky konjugátu ze sklíčka. Sklíčko se opláchne a umyje jako předtím (3.).
Opatrně se odstraní přebytečná vlhkost.
7. Napipetuje se 5 - 10 ul 0,1 M fosfátového pufru s glycerolem (dodatek 4) nebo komerční krycí tekutiny do každého okénka a přiloží se krycí sklíčko.
6.1.5.4. Vyhodnocení IF testu
1. Prohlížejí se testovací sklíčka epifluorescenčním mikroskopem s filtry vhodnými pro excitaci FITC pod olejovou nebo vodní imersí při zvětšení 500x až 1 000x. Zkoumají se okénka ve dvou navzájem kolmých průměrech a kolem obvodu. U vzorků s žádnými nebo malým počtem buněk se zkoumá nejméně 40 polí mikroskopu.
Nejdřív se zkontroluje pozitivní kontrolní vzorek. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela obarvené v určeném titru protilátky nebo pracovním ředění. Pokud je barevnost odchylná, musí být test IF opakován (odst. 6.1.5).
2. Pozorují se jasně fluoreskující buňky s charakteristickou morfologií R. solanacearum v testovacích okéncích sklíčka. Intenzita fluorescence musí být při porovnání s pozitivním kontrolním kmenem ve stejném ředění protilátky stejná nebo lepší. Buňky s neúplným zbarvením nebo slabou fluorescencí nelze brát v úvahu.
Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. To se může stát, když všechna sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky díky kontaminaci pufru nebo při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka sklíček) na povrchu sklíček.
3. Existuje několik problémů podstatných pro přesnost imunofluorescenčního testu. V peletách z pupkové části bramboru a částí stonku se mohou vyskytnout doprovodné populace fluoreskujících buněk s atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s velikostí a morfologií podobnou R. solanacearum.
4. Berou se v úvahu pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií v titru nebo pracovním ředění protilátek podle oddílu 6.1.5.3.
5. Interpretace výsledků testu IF:
i) Při zjištění jasně fluoreskujících buněk s typickou morfologií se odhadne průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopovém poli a vypočítá počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety (dodatek 5).
Výsledek IF je pozitivní u vzorků, kde je počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety nejméně
3
5 x 10 .
Vzorek je považován za potenciálně infikovaný a je povinné další testování.
ii) Výsledek IF testu je negativní pro vzorky, které obsahují méně než
3
5 x 10 .
buněk na 1 ml resuspendované pelety a vzorek se považuje za negativní. Další testování není nutné.
6.1.6. Testy PCR
Principy
Použije-li se test PCR jako hlavní screeningový test a výsledek je pozitivní, musí být povinně proveden druhý screeningový test, a sice izolace nebo IF. Jestliže je PCR použita jako druhý screeningový test a je pozitivní, je nutné provést další testování podle postupového diagramu, aby byla analýza úplná.
Využití této metody v celém rozsahu jako hlavního screeningového testu se doporučuje jen tehdy, je-li požadována specializovaná expertíza.
Poznámka:
Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění
3 4
10 až 10
buněk R. solanacearum na 1 ml přidaný do vzorků extraktů, které byly předtím testovány jako negativní. Dosažení maximální citlivosti a přesnosti ve všech laboratořích může vyžadovat optimalizační pokusy.
Použijí se schválená činidla a protokoly PCR (viz dodatek 6). Pokud možno, zvolí se metoda s interní kontrolou.
Je třeba použít vhodná bezpečnostní opatření k zabránění kontaminace vzorku cílovou DNA. Test PCR by měl být prováděn zkušenými laboranty v laboratořích specializovaných na molekulární biologii, aby se minimalizovala možnost kontaminace cílovou DNA.
S negativními kontrolami (v průběhu extrakce DNA a PCR) by se mělo vždy zacházet jako s konečnými vzorky, aby bylo jasné, jestli došlo k přenosu DNA.
PCR test by měl zahrnovat následující negativní kontroly:
- extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na R. solanacearum s negativním výsledkem,
- kontroly pufru používaného pro extrakci bakterií a DNA ze vzorku,
- reakční směs PCR.
Měly by být zahrnuty následující pozitivní kontroly:
- alikvotní části resuspendovaných pelet, do kterých byla přidána R. solanacearum (přípravu viz dodatek 3 B);
- suspenze
6
10
buněk na 1 ml R. solanacearum ve vodě z virulentního izolátu (např. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; viz dodatek 3 B);
- pokud možno, při PCR použít také DNA extrahovanou z pozitivních kontrolních vzorků.
Aby se zabránilo případné kontaminaci, připravují se pozitivní kontroly v prostředí odděleném od vzorků, které budou testovány.
Extrakty ze vzorků by měly být pokud možno bez zeminy. V případě použití PCR testu je potřeba připravit extrakty z umytých brambor.
Standardizované materiály k pozitivní a negativní kontrole, které lze použít pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3.
6.1.6.1. Metody purifikace DNA
Používají se výše popsané pozitivní a negativní kontrolní vzorky (viz. dodatek 3).
Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorků.
K purifikaci cílové DNA z komplexních substrátů vzorků jsou k dispozici různé metody odstraňující inhibitory PCR a jiných enzymových reakcí a koncentrující cílovou DNA ve vzorku. Následující metoda byla optimalizována pro použití se schválenými metodami PCR uvedenými v dodatku 6.
a) Metoda podle Patrika (2000)
1. Napipetuje se 220 μl lyzátového pufru [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] do 1,5 ml Eppendorfovy mikrozkumavky.
2. Přidá se 100 μl extraktu ze vzorku a mikrozkumavka se umístí do termobloku nebo vodní lázně s teplotou 95 °C na 10 min.
3. Mikrozkumavka se vloží na 5 min. do ledu.
4. Přidá se 80 μl zásobního roztoku lysozymu (50 mg lysozymu/na 1 ml 10 mM TrisHCl, pH 8,0) a inkubuje při teplotě 37 °C po dobu 30 minut.
5. Přidá se 220 μl roztoku Easy DNA® A (Invitrogen), dobře promíchá třepáním a inkubuje se při teplotě 65 °C po dobu 30 minut.
6. Přidá se 100 μl roztoku Easy DNA® B (Invitrogen), důkladně promíchá třepáním, pokud vzorek nezačne být stejnoměrně viskózní.
7. Přidá se 500 μl chloroformu a promíchá, až se viskozita sníží a směs se stane homogenní.
8. Pro oddělení fází a vytvoření mezifáze se směs odstřeďuje při 15 000 g po dobu 20 min. při teplotě 4 °C.
9. Horní fáze se převede do nové Eppendorfovy mikrozkumavky.
10. Přidá se 1 ml 100% etanolu (-20 °C), krátce promíchá třepáním a inkubuje se na ledu po dobu 10 min.
11. Odstřeďuje se při 15 000 g po dobu 20 minut při teplotě 4 °C a odstraní se etanol z pelety.
12. Přidá se 500 μl 80% etanolu (-20 °C) a promíchá se překlápěním mikrozkumavky.
13. Odstřeďuje se při 15 000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C, zachová se peleta a odstraní etanol.
14. Peleta se nechá uschnout na vzduchu nebo v DNA odparce.
15. Peleta se resuspenduje v 100 μl sterilní UPW a nechá se stát při pokojové teplotě nejméně 20 minut.
16. Skladuje se při teplotě -20 °C až do použití při PCR.
17. Jakákoliv bílá sraženina se odstraní odstředěním. 5 μl supernatantu obsahujícího DNA se použije pro test PCR.
b) Jiné metody
Jiné metody extrakce DNA, např. Qiagen DNeasy Plant Kit, by se mohly použít, pokud by se prokázalo, že jsou při purifikaci DNA z kontrolních vzorků obsahujících
3 4
10 až 10
patogenních buněk na 1 ml stejně efektivní.
6.1.6.2. PCR
1. Připraví se testované vzorky a kontroly pro PCR podle schválených protokolů (6.1.6). Připraví se desetinásobné ředění vzorku extraktu DNA (1 : 10 ve sterilní vodě).
2. Připraví se příslušná reakční směs pro PCR v prostředí, ve kterém nehrozí kontaminace podle zveřejněných protokolů (dodatek 6). Pokud možno, doporučuje se použít multiplexní protokol PCR, který rovněž zahrnuje interní protokol PCR.
3. Do sterilních PCR mikrozkumavek se přidá 5 μl extraktu DNA na 25 μl PCR reakce podle protokolů PCR (viz dodatek 6).
4. Přidají se negativní kontrolní vzorky obsahující pouze reakční směs PCR a přidá se týž zdroj UPW jako byl ten, který byl použit ve směsi PCR místo vzorku.
5. PCR mikrozkumavky se umístí do téhož termocykleru, který byl použit při počátečním testování, a spustí se vhodně optimalizovaný program PCR (dodatek 6).
6.1.6.3. Analýza produktu PCR
1. Amplikony se rozdělí elektroforézou v agarózovém gelu. Nanese se nejméně 12 μl směsi amplifikované DNA z každého vzorku s 3 μl nanášecího pufru (dodatek 6) do 2,0 % (w/v) agarózového gelu v Trisacetát-EDTA (TAE) pufru (dodatek 6) při 5 - 8 V/cm. Použije se vhodný DNA marker, např. (ladder) 100 bp.
2. Detekují se proužky DNA obarvením v ethidiumbromidu (0,5 mg/l) po dobu 30 - 60 minut za použití vhodných bezpečnostních opatření pro zacházení s tímto mutagenem.
3. V obarveném a UV (krátké vlnové délky např. 302 nm) prosvíceném gelu se hledají amplifikované produkty PCR o očekávané velikosti a výsledek se zdokumentuje.
4. U všech nových nálezů/případů se zkontroluje pravost amplikonu PCR provedením restrikční enzymové analýzy ve zbývajícím vzorku amplifikované DNA inkubací při optimální teplotě a čase shodným restrikčním enzymem a pufrem (viz dodatek 6). Naštěpené fragmenty se rozdělí elektroforézou v agarózovém gelu a pozoruje se charakteristický vzor restrikčních fragmentů pod UV světlem po obarvení ethidiumbromidem a porovnává se s neštěpenou a štěpenou pozitivní kontrolou.
Interpretace výsledků testu PCR
Test PCR je negativní, jestliže amplikon PCR specifický pro R. solanacearum očekávané velikosti není u zkoumaného vzorku zjištěn, ale je zjištěn u všech pozitivních kontrolních vzorků (v případě vícenásobné PCR s interními kontrolními primery specifickými pro rostlinu: druhý produkt PCR očekávané velikosti musí být amplifikován se zkoumaným vzorkem).
Test PCR je pozitivní, jestliže je zjištěn amplikon PCR specifický pro R. solanacearum očekávané velikosti a (případně) vzoru, za předpokladu, že není amplifikován u žádného vzorku negativní kontroly. Spolehlivé potvrzení pozitivního výsledku lze také získat opakováním testu s druhou sadou primerů PCR dodatek 6).
Poznámka:
Lze mít podezření na inhibici PCR, jestliže je získán očekávaný amplikon ze vzorku pozitivní kontroly obsahujícího R. solanacearum ve vodě, zatímco ze vzorku pozitivní kontroly R. solanacearum v bramborovém extraktu byly získány negativní výsledky. V multiplexních protokolech PCR s interními kontrolami PCR nasvědčuje inhibici reakce, jestliže není získán žádný ze dvou amplikonů.
V případě, že očekávaný amplikon je získán z jednoho nebo více vzorků negativních kontrol, je podezření na kontaminaci.
6.1.7. Test FISH
Princip
Když se jako první screeningový test použije FISH test a je pozitivní, musí být jako druhý povinný screeningový test provedena izolace nebo IF test. Když se FISH test provede jako druhý vyšetřovací test a je pozitivní, je k dokončení diagnózy nutné další testování podle postupového diagramu.
Poznámka:
Používají se schválené oligosondy specifické pro R. solanacearum (dodatek 7). Úvodní testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelné zjištění alespoň
3 4
10 - 10
buněk R. solanacearum na ml přidané do extraktů ze vzorku, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.
Následující postup by měl být pokud možno proveden s čerstvě připravenými extrakty, ale je možné jej úspěšně provést s extraktem, který byl uchován v glycerolu při teplotě -16 až -24 °C nebo -68 až -86 °C.
Jako negativní kontrola se použije alikvotní část extraktu ze vzorku, který byl předtím testován na R. solanacearum s negativním výsledkem.
Jako pozitivní kontrola se připraví suspenze obsahující
5 6
10 až 10
buněk na 1 ml R. solanacearum biovar 2 (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, viz dodatek 3) v 0,01M fosfátovém pufru (PB) ze 3 - 5 denní kultury. Připraví se samostatná sklíčka s pozitivními kontrolními vzorky homologického kmenu nebo jiného referenčního kmene R. solanacearum, suspendovaného v bramborovém extraktu, jak je uvedeno v dodatku 3 B.
Použití eubakteriálních oligosond značených FITC poskytuje kontrolu procesu hybridizace, protože zbarví všechny eubakterie přítomné ve vzorku.
Standardizovaný pozitivní a negativní kontrolní materiál, který se používá v tomto testu, je uveden v dodatku 3 bodu A.
Test kontrolního materiálu se provede stejným způsobem jako u vzorku(ů).
6.1.7.1. Fixace bramborového extraktu
Následující protokol vychází z Wullingse et al. (1998).
1 Připraví se fixační roztok (viz dodatek 7).
2. Napipetuje se 100 μl každého vzorkového extraktu do Eppendorfovy mikrozkumavky a odstřeďuje se po dobu 7 minut na 7 000 g.
3. Odstraní se supernatant a rozpustí se peleta ve 200 μl fixačního roztoku připraveného max. 24 hodin předem. Protřepe se a inkubuje 1 hodinu v chladícím zařízení.
4. Odstřeďuje se 7 minut při 7 000 g, odstraní se supernatant a resuspenduje se peleta v 75 μl 0,01 M PB (viz dodatek 7).
5. Kápne se 16 μl fixované suspenze na čisté 10 okénkové sklíčko, jak ukazuje obrázek 7.1, přičemž se použijí 2 různé vzorky na jedno sklíčko, a to neředěný a zředěný 1 : 100 s použitím 10 μl (v 0,01 M PB). Zbývající roztok vzorku (49 μl) může být uložen při teplotě -20 °C po přidání 1 objemového množství 96% etanolu. V případě, že je třeba FISH metodu opakovat, odstraní se etanol odstředěním a přidá se stejné množství 0,01 PB (zamíchá se protřepáním).
Obrázek 7.1 Rozmístění na sklíčku FISH
Obrázek 7.1
6. Sklíčka se nechají uschnout na vzduchu (nebo v sušičce sklíček při teplotě 37 °C) a fixují se nad plamenem.
V této fázi je možné postup přerušit a pokračovat v hybridizaci další den. Sklíčka by měla být skladována chráněna před prachem a v suchu při pokojové teplotě.
6.1.7.2. Hybridizace
1. Dehydratují se buňky v postupné etanolové řadě 50%, 80% a 96%, pokaždé po dobu 1 minuty. Osuší se vzduchem v držáku sklíček.
2. Připraví se vlhká inkubační komora přikrytím dna vzduchotěsného boxu tkaninou nebo filtračním papírem nasáklým hybridizační směsí (1x hybmix, dodatek 7). Před inkubací se ohřeje box v hybridizační peci při teplotě 45 °C po dobu nejméně 10 minut.
3. Použije se 10 μl hybridizačního roztoku (dodatek 7) na 8 okének (okénka 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 a 10; viz obr. 7.1) na každém sklíčku, přičemž dvě středová okénka (3 a 8)se nechají prázdná.
4. Přiloží se krycí sklíčka (24 x 24 mm) na první a poslední 4 okénka, a to tak, aby pod ně nevnikl vzduch. Sklíčka se umístí do předem zahřáté vlhké komory a nechá se proběhnout proces hybridizace po dobu 5 hodin v troubě při teplotě 45 °C v temnu.
5. Připraví se 3 kádinky obsahující 1 l vody s molekulární kvalitou (Milli Q), 1 l 1x hybmix (334 ml 3x hybmix a 666 ml vody s molekulární kvalitou) a 1 l 1/8x hybmixu (42 ml 3x hybmix a 958 ml vody s molekulární kvalitou). Nechají se inkubovat ve vodní lázni o teplotě 45 °C.
6. Sejmou se krycí sklíčka a podložní sklíčka se umístí do držáku sklíček.
7. Spláchne se nadbytek vzorku inkubací po dobu 15 minut v kádince s 1x hybmixem při teplotě 45 °C.
8. Držák sklíček se přemístí do promývacího roztoku 1/8 hybmix a nechá se inkubovat dalších 15 minut.
9. Sklíčka se krátce ponoří do UPW (např. Milli Q water) a položí na filtrační papír. Odstraní se nadbytečná vlhkost lehkým zakrytím povrchu filtračním papírem. Napipetuje se 5 - 10 μl krycího roztoku (např. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA nebo podobný) do každého okénka a celé sklíčko se zakryje velkým krycím sklíčkem (24 x 60 mm).
6.1.7.3. Hodnocení FISH testu
1. Sklíčka se ihned prohlížejí pod mikroskopem vhodným pro epifluorescenční mikroskopii se zvětšením 630 x nebo 1 000 x pod olejovou imerzí. S filtrem vhodným pro fluorescein isothiokyanat (FITC) jsou eubakteriální buňky (včetně většiny gramnegativních buněk) ve vzorku zbarveny fluorescenčně zeleně. Použitím filtru pro tetramethylrhodamin-5-isothiokyanat se buňky R. solanacearum obarvené Cy3 jeví fluorescenčně červené. Porovnává se buněčná morfologie s morfologií pozitivních kontrolních vzorků. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela zbarveny. Test FISH (odst. 6.1.7) musí být zopakován, pokud je zbarvení odchylné. Prohlížejí se okénka napříč dvěma průměry v pravých úhlech a kolem obvodu. U vzorků, kde nejsou pozorovány žádné nebo málo buněk, se pozoruje nejméně 40 polí mikroskopu.
2. Hledají se jasně fluoreskující buňky s morfologií charakteristickou pro R. solanacearum v okénkách testovacích sklíček. Intenzita fluorescence musí odpovídat nebo být lepší než u pozitivního kontrolního kmene. Buňky, které nejsou zcela zbarveny nebo vykazují slabou fluorescenci, se neberou v úvahu.
3. Při podezření na jakoukoli kontaminaci musí být test opakován. To může nastat v případě, kdy všechna sklíčka ve várce ukazují pozitivní buňky z důvodu kontaminace pufru nebo jestliže jsou pozitivní buňky zjištěny (vně okénka sklíčka) na krytu sklíčka.
4. Specifičnost testu FISH s sebou nese několik problémů. Je pravděpodobné, že u pletiv z bramborových hlíz a pelet ze stonkových partií bramboru dojde k výskytu populací fluorescenčních buněk na pozadí s atypickou morfologií a ke křížové reakci se saprofytickými bakteriemi velikostí a morfologií podobnými R. solanacearum, i když mnohem méně častěji než u testu IF.
5. V úvahu se berou pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií.
6. Interpretace výsledků testu FISH
i) Výsledky FISH testu jsou platné, pokud jsou při použití FITC filtru jasně zeleně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro R. solanacearum a při použití rhodaminového filtru jasně červeně fluoreskující buňky pozorovány ve všech pozitivních kontrolách a nejsou pozorovány v žádných negativních kontrolách. Pokud jsou přítomné jasně fluoreskující buňky s typickou morfologií, odhadne se průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopovém poli a vypočítá počet typických buněk v 1 ml resuspendované pelety (dodatek 4). Vzorky, které obsahují alespoň
3
5 x 10
typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za pravděpodobně infikované. Nutné je další testování. Vzorky, které obsahují méně než
3
5 x 10
typických buněk na 1 ml resuspendované pelety, se považují za negativní.
ii) Výsledek FISH testu je negativní, pokud při použití rhodaminového filtru nejsou pozorovány jasně červeně fluoreskující buňky s velikostí a morfologií typickou pro R. solanacearum, jestliže jsou tyto typické jasně červeně fluoreskující buňky při použití rhodaminového filtru pozorovány v pozitivních kontrolách.
6.1.8. Testy ELISA
Princip
Testy ELISA lze použít pouze jako volitelný test kromě testů IF, PCR nebo FISH pro jeho relativně nízkou citlivost. Při použití DAS ELISA je obohacení a použití monoklonálních protilátek povinné. Obohacení vzorků před použitím testu ELISA může zvýšit citlivost testu, ale může se rovněž setkat s nezdarem kvůli konkurenci jiných organismů ve vzorku.
Poznámka:
Použije se validovaný zdroj protilátek R. solanacearum. Doporučuje se určení titru pro každou novou šarži protilátek. Titr je definován jako nejvyšší ředění, při kterém dojde k optimální reakci při testování suspense obsahující
5 6
10 až 10 buněk
na 1 ml homologického kmene R. solanacearum a použití vhodných druhotných konjugátů protilátek podle doporučení výrobce. Při testování by měly být použity protilátky v pracovním ředění, které je blízké nebo stejné jako u titru komerční formulace.
Určí se titr protilátek pro suspenzi
5 6
10 až 10 buněk
na 1 ml homologického kmene R. solanacearum.
Vzorek, který byl předtím otestován jako R. solanacearum negativní a suspenze bakterií bez vzájemného působení v solném roztoku fosfátového pufru (PBS) se použijí jako vzorky negativní kontroly.
Jako pozitivní kontrolní vzorky se použijí alikvótní podíly vzorkových extraktů, které byly předtím otestovány jako negativní, s příměsí
3 4
10 až 10
buněk na 1 ml biovaru 2 R. solanacearum (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, viz dodatek 2 A a B). Pro srovnání výsledků na každé destičce se použije standardní suspenze
5 6
10 až 10
buněk na 1 ml v PBS R. solanacearum. Pozitivní kontrolní vzorky musí být na mikrotitrové destičce dobře odděleny od vzorků k testování.
Standardizované pozitivní a negativní materiály, které se používají pro tento test, jsou uvedeny v dodatku 3 bodu A.
Test kontrolního materiálu se provede týmž způsobem jako test vzorku(ů).
Validované jsou dva protokoly ELISA.
a) Nepřímý test ELISA (Robinson Smith et al., 1995)
1. Použije se 100 - 200 μl vzorkového extraktu. (Zahřátí na 100 °C na 4 minuty ve vodní lázni nebo topném boxu může v některých případech redukovat vznik nespecifických výsledků).
2. Přidá se stejné množství dvojnásobně silného uhličitanového krycího pufru (dodatek 4) a směs se promíchá.
3. Nakape se 100 μl do každé jamky mikrotitrační destičky (např. Nunc-Polysorp nebo rovnocenné) a nechá se inkubovat 1 hodinu při teplotě 37 °C nebo 14 - 18 h při teplotě 4 °C.
4. Extrakty se vylijí z jamek. Jamky se třikrát vymyji pomocí PBS-Tween (dodatek 4) a poslední vymývací roztok se nechá v jamce nejméně 5 minut.
5. Připraví se vhodné ředění protilátek proti R. solanacearum v blokačním pufru (dodatek 4). U validovaných komerčních protilátek se použijí doporučená ředění (obvykle dvojnásobné koncentrace, než je titr).
6. Přidá se 100 μl do každé jamky a nechá se inkubovat 1 hodinu při teplotě 37 °C.
7. Roztok protilátek se vylije z jamek a jamky se vymyjí jako předtím (bod 4.).
8. Připraví se vhodné ředění konjugátu alkalické fosfatázy v blokačním pufru. Přidá se 100 μl do každé jamky a nechá se inkubovat 1 hodinu při teplotě 37 °C.
9. Konjugát se vylije z jamek a jamky se vymyjí jako předtím (bod 4).
10. Přidá se 100 μl substrátového alkalického roztoku fosfatázy (dodatek 4) do každé jamky. Nechá se inkubovat v temnu při pokojové teplotě a odečítá se absorbance při 405 nm v pravidelných 90minutových intervalech.
b) DAS-ELISA
1. Připraví se vhodné ředění polyklonálního imunoglobulinu v uhličitanovém pufru pH 9.6 (dodatek 4). Přidá se 200 μl do každé jamky. Nechá se inkubovat při teplotě 37 °C 4 až 5 hodin nebo 4 °C po dobu 16 hodin.
2. Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4). Přidá se 190 μl extraktu ze vzorku do nejméně dvou jamek. Přidají se rovněž pozitivní a negativní kontrolní vzorky do dvou jamek na každé destičce. Nechá se inkubovat 16 hodin při teplotě 4 °C.
3. Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).
4. Připraví se vhodné ředění specifických monoklonálních protilátek R. solanacearum v PBS (dodatek 4) s obsahem 0,5 % hovězího sérového albuminu (BSA), přidá se 190 μl do každé jamky a nechá stát 2 hodiny při teplotě 37 °C.
5. Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).
6. Připraví se ředění protimyšího imunoglobulinu konjugovaného alkalickou fosfatázou v PBS. Přidá se 190 μl do každé jamky a nechá se inkubovat 2 hodiny při teplotě 37 °C.
7. Jamky se třikrát dobře vypláchnou použitím PBS-Tween (dodatek 4).
8. Připraví se roztok 1 mg p-NPP/ml alkalické fosfatázy v substrátovém pufru (dodatek 4). Přidá se 200 μl do každé jamky a inkubuje se v temnu při pokojové teplotě. Absorbance při 405 nm se odečítá v pravidelných intervalech 90 minut.
Interpretace výsledků testu ELISA
Test ELISA je negativní, jestliže průměrná hodnota optické hustoty (OH) z jamek se stejnými vzorky je menší než dvojnásobek OH u negativního kontrolního vzorku, pokud všechny hodnoty OH pozitivních kontrolních vzorků jsou větší než 1,0 (po 90 minutách inkubace se substrátem) a jsou větší než dvojnásobek OH získané z negativních vzorkových extraktů.
Test ELISA je pozitivní, jestliže průměrné hodnoty OH z jamek se stejným vzorkem jsou větší než dvojnásobek OH v negativním extraktu testovaného vzorku, pokud hodnoty OH ve všech negativních kontrolních vzorcích jsou menší než dvojnásobek hodnot v pozitivních kontrolních vzorcích.
Negativní hodnoty ELISA v pozitivních kontrolních vzorcích ukazují, že test nebyl proveden správně nebo že byl inhibován. Pozitivní hodnoty ELISA v negativních kontrolních vzorcích ukazují, že došlo k vzájemné kontaminaci nebo nespecifickému vázání protilátek.
6.1.9. Biotest
Poznámka.:
Předběžné testování touto metodou by mělo umožnit reprodukovatelnou detekci
3 4
10 až 10
jednotek tvořících kolonie R. solanacearum na 1 ml přidaný do extraktu ze vzorku, který byl předtím testován s negativním výsledkem (přípravu viz v dodatku 3).
Nejvyšší citlivost zjištění lze očekávat při použití čerstvě připraveného extraktu ze vzorku a v optimálních růstových podmínkách. Metodu lze však také úspěšně použít na extrakty, které byly uchovány v glycerolu v teplotě -68 až -86 °C.
Následující protokol vychází z Janseho (1988):
6.1.9.1. Použije se 10 testovacích rostlin citlivé odrůdy rajčete (např. kultivaru Moneymaker nebo kultivaru s rovnocennou citlivostí podle testovací laboratoře) ve fázi třech pravých listů u každého vzorku. Podrobnosti pěstování viz. v dodatku 8. Nebo se použije lilek (např. kultivar Black Beauty nebo kultivary s rovnocennou citlivostí), ale jen rostliny ve fázi 2. až 3. listů až do plného rozvinu třetího pravého listu. Příznaky u lilku jsou méně výrazné a vyvíjejí se pomaleji. Pokud možno, doporučujeme proto použít sazenice rajčat.
6.1.9.2. Rozdělí se 100 μl extraktu ze vzorku mezi testovací rostliny.
1. Inokulace injekční stříkačkou
Inokulují se stonky rostlin hned nad děložními listy pomocí stříkačky s podkožní jehlou (ne méně než 23G). Vzorek se rozdělí mezi testovací rostliny.
2. Inokulace zářezem
Rostlina se přidrží mezi dvěma prsty a pipetou se kápne přibližně 5 - 10 μl suspendované pelety na stonek mezi děložními listy a prvním listem.
Sterilním skalpelem se udělá příčný řez asi 1 cm dlouhý a hluboký přibližně 2/3 tloušťky stonku, přičemž řez se začne v místě kapky resuspendované pelety.
Řez se utěsní sterilní vazelínou z injekční stříkačky.
6.1.9.3. Stejnou technikou se nainokulujte 5 sazenic vodní suspenzí
5 6
10 až 10
buněk na 1 ml, připravenou ze 48 hodinové kultury virulentního kmene biovaru 2 R. solanacearum jako pozitivní kontrolní vzorek, a peletovým pufrem (dodatek 4) jako negativní kontrolní vzorek. Oddělí se pozitivní a negativní kontrolní rostliny od ostatních rostlin, aby se zabránilo vzájemné kontaminaci.
6.1.9.4. Testovací rostliny se nechají růst v karanténním zařízení 4 týdny při teplotě 25 - 30 °C a vysoké relativní vlhkosti s přiměřeným zavlažováním, aby se zabránilo jak přemokření, tak vadnutí z důvodu nedostatku vody. Aby se zabránilo kontaminaci, musí být drženy pozitivní a negativní kontrolní rostliny ve zcela oddělených místech skleníku nebo vegetační komory nebo jinak přísně izolovány. Musejí-li být rostliny z různých vzorků po dobu inkubace drženy blízko sebe, oddělí se vhodnými zástěnami. Při hnojení, zalévání, prohlížení a všech ostatních činnostech se věnuje zvláštní pozornost tomu, aby nedošlo k vzájemné kontaminaci. Nutné je udržovat skleník nebo vegetační prostor bez hmyzích škůdců, protože by mohli přenést bakterie mezi vzorky.
Hledají se příznaky vadnutí, epinastie, chloróz anebo krnění rostlin.
6.1.9.5. Z infikovaných rostlin se provede izolace (odst. 2.3) a identifikují se podezřelé čisté kultury (bod 6.2.).
6.1.9.6. Jestliže během 3 týdnů nejsou pozorovány žádné příznaky, provede se test IF/PCR/izolace na složeném vzorku ze segmentů stonků dlouhých 1 cm z každé testovací rostliny, odebraných nad místem inokulace. Je-li test pozitivní, provedou se zřeďovací roztěry (bod 4.1).
6.1.9.7. Identifikují se všechny čisté kultury s podezřením na R. solanacearum (bod 6.2.).
Interpretace výsledků biotestu
Platné výsledky biotestu jsou získány, jestliže pozitivní kontrolní testovací rostliny vykazují typické příznaky, bakterie mohou být z těchto rostlin znovu izolovány a negativní kontrolní rostliny nevykazují žádné příznaky.
Biotest je negativní, jestliže rostliny nejsou infikovány bakteriemi R. solanacearum, pokud byl organismus zjištěn u pozitivních kontrolních testovacích rostlin.
Biotest je pozitivní, jestliže testovací rostliny jsou infikovány bakteriemi R. solanacearum.