4.2. Metody detekce a identifikace R. solanacearum ve vodě
Princip
Validované schéma detekce popsané v tomto oddíle je použitelné k detekci patogenu ve vzorcích povrchové vody a rovněž může být použito k testování vzorků odpadní vody ze zpracování brambor a odpadní vody. Očekávaná citlivost detekce se však liší v závislosti na substrátu. Citlivost testu selektivní izolace je ovlivňována populacemi konkurenčních saprofytických bakterií, kterých je obecně mnohem více v odpadní vodě ze zpracování brambor a odpadní vodě než v povrchové vodě. Zatímco níže uvedené schéma předpokládá detekci asi
3
10
buněk/litr povrchové vody, citlivost detekce v odpadní vodě ze zpracování brambor a odpadní vodě bude pravděpodobně podstatně nižší. Z tohoto důvodu se doporučuje testovat odpadní vodu po provedení nějakého čistícího postupu (např. sedimentace nebo filtrace), při nichž dojde ke snížení saprofytických bakteriálních populací. Omezení citlivosti testovacího schématu by mělo být bráno v úvahu při hodnocení spolehlivosti v případě získání negativních výsledků.Vzhledem k tomu, že se toto schéma používá úspěšně k mapování výskytu nebo nepřítomnosti patogenu v povrchové vodě, je třeba si uvědomit jeho omezení při použití k podobnému mapování v odpadní vodě ze zpracování brambor a v odpadní vodě.
4.2.1. Příprava vzorků
Poznámka:
- Zjištění R. solanacearum v povrchové vodě je nejspolehlivější v období pozdního jara, léta a podzimu, kdy teplota vody překračuje 15 °C.
- Opakované vzorkování v různé době během výše uvedených období na určených vzorkovacích místech zvýší spolehlivost zjištění snížením vlivů výkyvů povětrnostních podmínek.
- Vlivem silných dešťů a geografie vodního toku může dojít ke značnému zředění a tím i zastření výskytu patogenu.
- Vzorky vody se odebírají v blízkosti hostitelských rostlin, pokud jsou přítomny.
4.2.1.1. Na vybraných vzorkovacích místech se odeberou vzorky vody do sterilních zkumavek nebo lahviček na jedno použití, pokud možno 30 cm pod hladinou a 2 m od břehu. Při vzorkování odpadní vody ze zpracování brambor a odpadní vody se odeberou vzorky z místa výtoku odpadní vody. Doporučená velikost vzorku je 500 ml. Je-li upřednostňována menší velikost, doporučuje se odebrat vzorky nejméně 3krát pro každé vzorkovací místo, z nichž každý bude obsahovat 2 opakované dílčí vzorky o velikosti nejméně 30 ml. Při intenzivním mapování se vyberou nejméně 3 vzorkovací místa na každé 3 km vodního toku a vzorkují se rovněž přítoky.
4.2.1.2. Vzorky se přepravují v chladu a temnu (4 - 10 °C) a testují do 24 hodin.
4.2.1.3. Je-li potřeba, může být provedena koncentrace bakteriální frakce pomocí následujících metod:
a) Odstřeďují se 30 - 50 ml dílčí vzorky při 10 000 g po dobu 10 minut (nebo 7 000 g po dobu 15 minut), pokud možno při teplotě 4 - 10 °C, slije se kapalina nad usazeninou a resuspenduje se peleta v 1 ml pufru (dodatek 4).
b) Provede se filtrace přes membránu (minimální velikost pórů 0,45 μm) s následným promytím filtru v 5 - 10 ml peletového pufru a zachycením filtrátu. Tato metoda je vhodná pro velké objemy vody, které obsahují malý počet saprofytů.
Koncentrace se obvykle nedoporučuje u vzorků vody ze zpracování brambor nebo u vzorků odpadní vody, protože zvýšená populace konkurenčních saprofytických bakterií inhibuje detekci Ralstonia solanacearum.
4.2.2. Testování
Viz. postupový diagram a popis testů v příslušných dodatcích.