2. Protokol PCR Pastrika a Maisse (2000)
2.1. Oligonukleotidové primery
Přímý primer Ps-1: 5'-agt cga acg gca gcg ggg g-3'
Reverzní primer Ps-2: 5'-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3'
Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum DNA = 553 bp.
2.2. Reakční směs PCR
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Reagencie | Množství v reakci | Konečná koncentrace |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Sterilní UPW | 16,025 μl | |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| 10x pufr PCR 1) | 2,5 μl | 1x (1,5 mM MgCl ) |
| | | 2 |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| BSA (frakce V) (10 %) | 0,25 μl | 0,1 % |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Směs dNTP (20 mM) | 0,125 μl | 0,1 mM |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Primer Ps-1 (10 μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Primer Ps-2 (10 μM) | 0,5 μl | 0,2 μM |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Taq polymerasa (5 U/μl) 1) | 0,1 μl | 0,5 U |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Množství vzorku | 5,0 μl | |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Celkové množství | 25,0 μl | |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.
Poznámka:
Původně optimalizovaná pro termocykler MJ Research PTC 200 s polymerasou Gibco Taq Polymerace. Perkin Elmer AmpliTaq a pufr mohou být rovněž použity ve stejných koncentracích.
2.3 Reakční podmínky PCR
Provede se následující cyklický proces:
1 cyklus: i) 5 minut při 95 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů: ii) 30 sekund při 95 °C (denaturace templátové DNA)
iii) 30 sekund při 68 °C (hybridizace primerů
s templátovou DNA)
iv) 45 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus: v) 5 minut při 72 °C (syntéza extenze)
vi) ponechá se při teplotě 4 °C.
Poznámka:
Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru MJ Research PTC 200. Použití jiných přístrojů bude možná vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).
2.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu
Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí zřetelný polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Taq I po inkubační době 30 minut při teplotě 65 °C. Restrikční fragmenty specifické pro R. solanacearum mají velikost 457 bp a 96 bp.