331/2004 Sb. Vyhláška o opatřeních k zabezpečení ochrany proti zavlékání a šíření původce bakteriální kroužkovitosti bramboru a původce bakteriální hnědé hniloby - 1. Protokol PCR Seal et al. (1993)

1. Protokol PCR Seal et al. (1993)

1.1. Oligonukleotidové primery

Přímý primer OLI-1: 5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'
Reverzní primer Y-2: 5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'

Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 288 bp

1.2. Reakční směs PCR

+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Reagencie | Množství v reakci | Konečná koncentrace |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Sterilní UPW | 17,65 μl | |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| 10x pufr PCR 1) (15 mM MgCl ) | 2,5 μl | 1x (1,5 mM MgCl ) |
| 2 | | 2 |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Směs dNTP (20 mM) | 0,25 μl | 0,2 mM |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Primer OLI-1 (20 μM) | 1,25 μl | 1 μM |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Primer Y-2 (20 μM) | 1,25 μl | 1 μM |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Taq polymerasa (5 U/μl) 1) | 0,1 μl | 0,5 U |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Množství vzorku | 2,0 μl | |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+
| Celkové množství | 25 μl | |
+-------------------------------+-------------------+---------------------+

1) Metoda byla validována použitím Taq polymerázy Perkin Elmer (AmpliTaq) a Gibco BRL.

1.3. Reakční podmínky PCR

Provede se následující cyklický proces:

1 cyklus: i) 2 minuty při 96 °C (denaturace templátové DNA)
35 cyklů: ii) 20 sekund při 94 °C (denaturace templátové DNA)
iii) 20 sekund při 68 °C (hybridizace primerů
s templátovou DNA)
iv) 30 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
1 cyklus: v) 10 minut při 72 °C (závěrečná syntéza)
vi) ponechá se při teplotě 4 °C.

Poznámka:

Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru Perkin Elmer 9600. Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).

1.4. Restrikční enzymová analýza amplikonu.

Produkty PCR vzniklé amplifikací z R. solanacearum DNA vytvářejí polymorfismus délky restrikčních fragmentů s enzymem Ava II po inkubaci při teplotě 37 °C.