2. Údaje
1.8. Kvalita a kvantita údajů
Údaje musí umožňovat smysluplnou analýzu vztahu koncentrace-odezva při aplikaci UVA/VIS záření a bez ní. Je-li zjištěna cytotoxicita, koncentrační rozsah a postup jednotlivých koncentrací se nastaví tak, aby se experimentální údaje daly vyjádřit křivkou. Jelikož testovaná látka může být až do definované limitní koncentrace 100 μg/ml v experimentu ve tmě (-UVA) necytotoxická, ale při ozařování (+UVA) vysoce cytotoxická, může dojít k tomu, že se koncentrační rozsahy v obou částech experimentu budou muset řádově lišit, aby byl splněn požadavek adekvátní kvality dat. Pokud není cytotoxicita zjištěna v žádné z obou částí experimentu (ani při - UVA, ani při +UVA), postačuje testování s velkým rozestupem mezi jednotlivými dávkami až do nejvyšší koncentrace.
Jsou-li výsledky hraniční - blízko dělící čáry predikčního modelu - je třeba test pro ověření opakovat.
Považuje-li se opakování testu za potřebné, může být důležité pozměnit experimentální podmínky, aby se dosáhlo jasného výsledku. Klíčovou proměnnou v tomto testu je příprava roztoků testované látky, nejvhodnější při jeho opakování je variace těchto podmínek (spolurozpouštědlo, triturace, sonifikace). Lze také uvažovat o změnách inkubační doby před ozařováním. U látek, jež jsou ve vodě nestálé, může mít významný vliv zkrácení doby.
1.9. Zpracování výsledků
Pokud je to možné, stanoví se koncentrace testované látky vedoucí k 50% inhibice buněčného příjmu NR (EC50). To lze učinit tak, že se na data koncentrace-odezva použije jakákoliv vhodná metoda nelineární regrese (nejlépe Hillova funkce nebo logistická regrese) nebo se použije jiná vhodná metoda proložení (14). Než se hodnota EC50 použije pro další výpočty, je třeba zkontrolovat kvalitu proložení. K výpočtu hodnoty EC50 je také možno použít grafické metody. V tomto případě se doporučuje použít pravděpodobnostní papír (osa x: log, osa y: probit), protože po této transformaci bývá křivka koncentrace-odezva mnohdy téměř lineární.
1.10. Vyhodnocení výsledků (predikční modely)
1.10.1. Predikční model, verze 1: fotoiritační faktor (PIF)
Pokud se získají úplné křivky koncentrace-odezva jak za přítomnosti (+UVA), tak za nepřítomnosti (-UVA) světla, se fotoiritační faktor (PIF) vypočítá podle vzorce
EC50(-UV)
(a) PIF=--------------
EC50(+UV)
PIF<5, nepředpovídá žádný fototoxický potenciál, kdežto PIF ≥ 5 fototoxický potenciál předpovídá.
Je-li látka cytotoxický pouze při +UVA, kdežto při -UVA je necytotoxická, nedá se PIF vypočítat, i když se jedná o výsledek, který indikuje, že látka má fototoxický potenciál. V takovémto případě se dá vypočítat tzv. "> PIF", když se test cytotoxicity (-UV) provede až po maximální zkušební koncentraci (Cmax) a tato hodnota se dosadí do vzorce:
Cmax (-UV)
(b)>PIF = ----------------
EC50(+UV)
Pokud se dá vypočítat pouze ">Pif", pak každá hodnota >1 předpovídá fototoxický potenciál.
Jestliže se nedá vypočítat ani EC50 (-UV), ani EC (+UV), protože látka nevykazuje cytotoxicitu až do nejvyšší zkušební koncentrace, je to indikací toho, že látka nemá žádný fototoxický potenciál. V takovémto případě se používá formální "PIF = *1", čímž se charakterizuje výsledek
Cmax(-UV)
(c) PIF = *1 = -------------
Cmax(+UV)
Pokud se dá získat pouze hodnota "PIF = *1", předpovídá to, že není přítomen žádný fototoxický potenciál.
V případech (b) a (c) je třeba při predikci fototoxického potenciálu vzít bedlivě v úvahu koncentrace, jichž se při testu dosáhlo.
1.10.2. Predikční model, verze 2: střední fotoefekt (MPE)
Je možno také použít novější verze modelu pro predikci fototoxického potenciálu, vypracovaného za použití dat z validační studie EU/COLIPA (15) a odzkoušeného za podmínek slepé studie stanovení fototoxicity in vitro u látek UV filtrů (13). V tomto modelu jsou překonána omezení modelu PIF v těch případech, kde nelze získat hodnotu EC50. V tomto modelu se používá veličina "střední fotoefekt" (MPE) založená na porovnání celého průběhu křivek koncentrace-odezva. Pro aplikaci modelu MPE byl na Humboldtově univerzitě v Berlíně vyvinut speciální počítačový software, která lze obdržet zdarma.
1.11. Interpretace výsledků
Pozitivní výsledek testu (PIF ≥ 5 nebo MPE ≥ 0,1) ukazuje, že daná látka má fototoxický potenciál. Pokud se k tomuto výsledku dojde při koncentracích nižších než 10 μg/ml, je pravděpodobné, že látka bude působit jako fototoxin také za různých expozičních podmínek in vivo. Získá-li se pozitivní výsledek pouze při nejvyšší zkušební koncentraci (100 μg/ml), bude pro posouzení nebezpečnosti nebo fototoxické schopnosti dané látky nejspíše zapotřebí dalších informací. Sem mohou spadat informace o penetraci, absorpci a možné akumulaci látky v kůži, nebo údaje z testování dané látky v jiném potvrzujícím alternativním testu, například za použití modelu lidské kůže in vitro.
Negativní výsledek testu fototoxicity 3T3 NRU in vitro (PIF <5 nebo MPE ≥ 0,1) ukazuje, že testovaná látka není fototoxická pro použité savčí buňky v daných podmínkách. V případech, kdy by se látka dala testovat i při nejvyšší koncentraci 100 μg/ml, negativní výsledek znamená, že látka nemá žádný fototoxický potenciál a fototoxicita in vivo se dá považovat za nepravděpodobnou. V případech, kdy byly při nižších koncentracích získány identické koncentrační závislosti toxické reakce (EC50 +UV a EC50 -UV), je interpretace dat stejná. Naproti tomu pokud nebyla prokázána žádná toxicita (+UV ani -UV) a pro omezenou rozpustnost látky se nedalo dosáhnout koncentrace 100 μg/ml, je možno uvažovat o jiném, potvrzujícím testu (například s použitím modelu kůže in vitro nebo modelu kůže ex vivo nebo test in vivo).