1. Metoda

1. Metoda

1.1. Úvod

Fototoxicita je definována jako toxická odezva (reakce), k níž dochází, je-li kůže poprvé vystavena určitým chemickým látkám a následně pak světlu, nebo je-li podobně kůže ozářena po celkovém podání určité látky.

Informace získané v rámci testu fototoxicity 3T3 NRU in vitro slouží ke stanovení fototoxického potenciálu dané testované látky, tedy ke zjištění, zda daná látka ve spojení s expozicí ultrafialovému a viditelnému záření představuje možné nebezpečí nebo nikoli.

Toxikologickým výsledkem testu in vitro je stanovení fototoxicity vyvolané kombinovaným působením látky a světla, tímto testem je možné zjistit sloučeniny, které jsou fototoxické in vivo po celkové aplikaci a distribuci v kůži, a sloučeniny, jež působí jako fotoiritanty po topickém nanesení na pokožku.

Test fototoxicity 3T3 NRU in vitro byl vypracován a validován v rámci společného projektu EU/COLIPA z let 1992 - 1997 (1) (2) (3) jakožto validní alternatia in vitro vůči různým používaným testům in vivo. V roce 1996 doporučila pracovní schůze OECD přístup následných in vitro testů pro hodnocení fototoxicity (4).

Výsledky testu fototoxicity 3T3 NRU in vitro byly porovnány s akutními účinky fototoxicity/fotoiritace in vivo u zvířat a lidí a bylo zjištěno, že tento test má pro uvedené účinky vynikající predikční schopnosti. Test není navržen k tomu, aby předpovídal jiné nepříznivé účinky, jež mohou z kombinovaného působení látky a světla vzniknout, jako je fotogenotoxicita, fotoalergie nebo fotokarcinogenita, i když řada látek tyto specifické vlastnosti vykazuje, reaguje při testu fototoxicity 3T3 NRU in vitro pozitivně. Test není rovněž uspořádán tak, aby umožňoval hodnocení stupně fototoxicity.

Sekvenční přístup testování fototoxicity u chemických látek je přiložen viz dodatek.

1.2. Definice

Iradiance: intenzita ultrafialového (UV) či viditelného záření dopadajícího na povrch; měřená ve W/m2 nebo v mW/cm2.

Dávka světla: množství (= intenzita x čas) ultrafialového (UV) nebo viditelného (VIS) záření dopadajícího na povrch, vyjádřené v joulech (= W x s) na jednotku povrchu, např. J/m2 nebo J/cm2.

Pásma vlnových délek ultrafialového světla: podle doporučení CIE (Commission International de L'Eclairage) se používá označení UVA (315 - 400nm), UVB (280 - 315 nm) a UVC (100 - 280 nm). Používají se i jiná vymezení: za hranici mezi pásmy UVA a UVB se často považuje 320 nm a UVA se někdy dělí na UV-A1 a UV-A2 s hranicí zhruba u 340 nm.

Životaschopnost (viabilita) buněk: parametr, kterým se měří celková aktivita buněčné populace (např. příjem barviva indikujícího živou buňku, neutrální červeně,do buněčných lysozomů), jež podle parametrů měřených daných testem a jeho uspořádání koreluje s celkovým počtem resp. životností (vitalitou) buněk.

Relativní životaschopnost (viabilita) buněk: životaschopnost buněk vyjádřená v porovnání s negativními kontrolami (rozpouštědlo), které prošly celou procedurou testu (buď +UV nebo -UV), ovšem bez působení testované látky.

Predikční model: algoritmus, kterým se výsledky testu toxicity transformují do predikce toxického potenciálu. V tomto metodickém návodu pro test je možno k transformaci výsledků testu na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro k predikci fototoxického potenciálu použít veličin PIF a MPE.

PIF (photo irritation factor, fotoiritační faktor): koeficient představující poměr dvou stejně účinných cytotoxických koncentrací (EC50) testované látky získaných v nepřítomnosti (-UV) a v přítomnosti (+UV) necytotoxického UVA/VIS ozáření.

MPE (mean photo effect, střední fotoefekt): nová míra odvozená z matematické analýzy kompletního průběhu dvou křivek koncentrace-odezva získaných v nepřítomnosti (-UV) a v přítomnosti (+UV) necytotoxického UVA/VIS ozáření.

Fototoxicita: akutní toxická reakce (odezva), která vzniká po první expozici kůže určité látce a následné expozici kůže světlu, nebo reakce která je obdobně navozena ozářením kůže po systémovém podání určité látky.

Fotoiritace: nižší úroveň pojmu "fototoxicita", týkající se pouze těch fototoxických reakcí, k nimž dochází v kůži poté, co na ni působí (topicky nebo orálně přijatá) nějaká látka. Tyto fototoxické reakce vedou vždy k nespecifickému poškození buněk (reakce podobné jako při nadměrném slunění).

Fotoalergie: získaná imunologická reaktivita, která se při prvním působení látky a světla neprojevuje, a kdy je zapotřebí jednotýdenní až dvoutýdenní indukční periody k tomu, aby se reaktivita kůže projevila.

Fotogenotoxicita: genotoxická reakce (odezva) s genetickými projevy, ke které dochází poté, co byly buňky vystaveny negenotoxické dávce UV/VIS záření a negenotoxické látky.

Fotokarcinogenita: karcinogenita vyvolaná opakovanou aplikací světla a látky. Pokud je tumorogeneze vyvolaná UV zářením zesílena látkou, mluvíme o fotokkokarcinogenitě.

1.3. Referenční látky

Vedle chlorpromazinu jako látky pro pozitivní kontrolu, která je souběžně testována při každé studii, se pro zavedení testu na fototoxicitu 3T3 NRU doporučuje použít jako referenční látky podsoubor z látek, které byly použity při mezilaboratorním porovnávání tohoto testu (1) (3) (13).

1.4. Prvotní úvahy

Fototoxické účinky byly pozorovány u řady látek (5) (6) (7) (8), jejichž jediným společným rysem je to, že dokáží absorbovat světelnou energii v oblasti slunečního záření. Podle prvního zákona fotochemie (Grotthausův-Draperův zákon) vyžaduje každá fotoreakce dostatečnou absorpci světelných kvant. Proto by se předtím, než se začne uvažovat o biologickém testování podle tohoto metodického návodu, mělo by se vždy stanovit absorpční spektrum testované látky v UV/VIS oblasti (například podle zkušební metody OECD č. 101). Pokud je molární extinkční/absorpční koeficient nižší než 10 litrů x mol-1 x cm-1, nemá látka fotoreaktivní potenciál a není třeba ji na škodlivé fotochemické účinky testovat ani testem na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro, ani žádným jiným biologickým testem (viz dodatek).

1.5. Princip metody

Byly zjištěny čtyři mechanismy, kterými může absorpce světla (chemickým) chromoforem vyústit ve fototoxickou reakci (7), přičemž všechny vedou k poškození buněk. Proto je test fototoxicity 3T3 NRU in vitro založen na porovnání cytotoxicity látky testované v přítomnosti a nepřítomnosti necytotoxické dávky UVA/VIS záření. Cytotoxicita se při tomto testu vyjadřuje jako koncentračně závislý pokles příjmu vitálního barviva, neutrální červeně (neutral red, NR) (9), 24 hodin po působení testované látky a ozařování.

Buňky Balb/c 3T3 se kultivují po dobu 24 hodin tak, aby se vytvořila kultura buněk v jedné vrstvě (monolayer). Pro každou testovanou látku se preinkubují dvě destičky po 96 jamkách s látkou v osmi různých koncentracích po dobu 1 hodiny. Jedna z obou destiček se pak vystaví necytotoxickému UVA/VIS záření v dávce 5 J/cm2 UVA (+ UV experiment), druhá destička se uchovává v temnu (- UV experiment). V obou destičkách se pak médium nahradí médiem kultivačním a po dalších 24 hodinách kultivace se pomocí inkorporace neutrální červeně (neutral red uptake, NRU) po dobu 3 hodin stanoví životaschopnost buněk, vyjádřená jako procento hodnot u negativních kontrol. K posouzení fototoxického potenciálu se porovnají koncentračně závislé reakce získané v přítomnosti (+UV) a v nepřítomnosti (-UV) záření, obvykle na úrovni EC50, tj. při koncentraci inhibující životaschopnost buněk o 50% v porovnání s kontrolami bez ovlivnění.

1.6. Kritéria jakosti

Citlivost buněk vůči záření UVA, historické údaje: u buněk je třeba pravidelně provádět kontrolu citlivosti vůči záření UVA. Buňky se nasadí v hustotě, která se používá při testu fototoxicity 3T3 NRU in vitro, příští den se vystaví záření UVA v dávce 1 - 9 J/cm2 a další den se testem NRU stanoví životaschopnost buněk. Buňky splňují kritéria jakosti, jestliže jejich životaschopnost po ozáření dávku UVA záření 5 J/cm2 není nižší než 80% životaschopnosti kontrolních vzorků uchovávaných v temnu. Při nejvyšší dávce UVA záření 9 J/cm2 nemá být životaschopnost nižší než 50% životaschopnosti vzorků uchovávaných v temnu. Tato kontrola se provádí zhruba po každé desáté pasáži buněk.

Citlivost buněk negativní kontroly vůči záření UVA, běžný test: test splňuje kritéria jakosti jestliže negativní kontroly (buňky v Earlově vyváženém solném roztoku [ Earl's balanced salt solution, EBSS] s 1% roztokem dimethylsulfoxidu (DMSO) nebo ethanolu (EtOH) nebo bez nich vykazují v experimentu (+UVA) životaschopnost minimálně 80% v porovnání s neozářenými buňkami v témž rozpouštědle v rámci souběžného experimentu v temnu (-UVA).

Životaschopnost negativních kontrol: absolutní optická hustota (OD540NRU) měřená v NR extraktu negativních kontrol ukazuje, zda oněch 1 x 104 buněk nasazených v každé jamce rostlo během dvou dnů testu s normální dobou zdvojnásobení. Test splňuje kritéria akceptovatelnosti, je-li průměrná hodnota OD540NRU u kontrol bez ovlivnění větší nebo rovna 0,2.

Pozitivní kontrola: při každém testu na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro je třeba provést souběžný test se známou fototoxickou látkou. Při validační studii EU/COLIPA byl jako látka pro pozitivní kontrolu použit chlorpromazin (CPZ); proto se tato látka doporučuje. Pro CPZ testovaný dle standardního protokolu v testu fototoxicity 3T3 NRU in vitro byla definována tato kritéria akceptovatelnosti: CPZ ozářený (+UVA): EC50 = 0,1 - 2,0 μg/ml, CPZ neozářený (-UVA): EC50 = 7,0 - 9,0 μg/ml. Fotoiritační faktor (PIF), tzn. posun hodnoty EC50, má být minimálně 6.

Místo CPZ se pro souběžnou pozitivní kontrolu dají použít i jiné známé fototoxické látky, pokud jsou vhodné pro charakteristiku chemické skupiny nebo rozpustnosti testované (hodnocené) látky. V takovém případě je třeba na základě historických dat adekvátně definovat jako kritéria akceptovatelnosti rozsahy hodnot EC50 a PIF nebo MPE (střední fotoofekt).

1.7. Popis metody

1.7.1. Příprava

1.7.1.1. Buňky

Při validační studii byla použita stabilizovaná buněčná linie myších fibroblastů Balb/c 3T3 klon 31, a to buď z ATCC nebo z ECACC; ta se proto doporučuje. Podle stejného protokolu se dají s úspěchem použít i jiné buňky nebo buněčné linie, pokud se kultivační podmínky upraví podle jejich specifických potřeb; je však třeba prokázat, že jsou stejně vhodné.

U buněk je třeba pravidelně kontrolovat, že nejsou kontaminovány mykoplazmaty, a smí se použít jen v případě, že je výsledek kontroly uspokojivý.

Jelikož citlivost buněk vůči UVA záření může s počtem pasáží narůstat, je třeba používat buňky Balb/c 3T3 z pasáže s nejnižším číslem, pokud možno nižším než 100. Citlivost buněk Balb/c 3T3 vůči UVA záření je třeba pravidelně kontrolovat, a to postupem kontroly jakosti popsaným v tomto metodickém návodu.

1.7.1.2. Média a kultivační podmínky

Pro rutinní pasážování buněk a během postupu je třeba používat vhodná kultivační média a inkubační podmínky. V případě buněk Balb/c 3T3 se jedná o DMEM obohacený 10% séra novorozených telat, 4 mM glutaminu, penicilinem a streptomycinem a o inkubaci ve vlhkém prostředí při teplotě 37°C / 7,5% CO2. Je nezbytné, aby podmínky kultivace zajišťovaly buněčný cyklus v normálním historickém rozmezí pro dané buňky resp. buněčnou linii.

1.7.1.3. Příprava kultur

Buňky ze zmražených zásobních kultur se nasadí v příslušné hustotě v kultivačním médiu a minimálně jednou se před použitím v testu na fototoxicity 3T3 NRU in vitro pasážují.

Pro test fototoxicity se buňky nasadí v kultivačním médiu v takové hustotě, aby na konci testu (tj. kdy se stanovuje životaschopnost buněk 48 hodin po nasazení) nedošlo ke konfluenci (ke splynutí v souvislou, jednolitou vrstvu buněk). V případě buněk Balb/c 3T3 kultivovaných v destičkách s 96 jamkami se doporučuje hustota 1 x 104 buněk v jedné jamce.

Pro každou testovanou látku se buňky nasazují identicky na dvě destičky s 96 jamkami, které pak procházejí celým postupem za identických kultivačních podmínek, s výjimkou doby, kdy je jedna z destiček ozařována (+UVA/VIS) a druhá je uchovávána v temnu (-UVA/VIS).

1.7.1.4. Metabolická aktivace

Zatímco při všech testech in vitro pro posouzení genotoxického nebo karcinogenního potenciálu je obecným požadavkem použití metabolizujícího systému, není v případě fototoxikologie známa žádná látka, kde by k tomu, aby působila jako fototoxin in vivo nebo in vitro, bylo metabolické transformace zapotřebí. Nepokládá se proto ani za nutné, ani za vědecky odůvodněné, aby se tento test prováděl s nějakým metabolickým aktivačním systémem.

1.7.1.5. Testovaná látka / příprava

Testovaná látka musí být před použitím čerstvě připravena, ledaže údaje o její stabilitě prokazují, že se dá skladovat. Pokud je pravděpodobně, že by došlo k fotodegradaci, musí se příprava provádět pod červeným světlem.

Látka se rozpustí v pufrovaném solném roztoku, například v Earlově vváženém solném roztoku (EBSS) nebo ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (phosphate buffered saline, PBS), který - aby nemohlo dojít k interferenci během ozařování - nesmí obsahovat žádné proteinové složky ani barevné indikátory pH, pohlcující světlo.

Pokud je testovaná látka ve vodě omezeně rozpustná, rozpustí se ve vhodném rozpouštědle v koncentraci stonásobně vyšší, než je požadovaná konečná koncentrace, a následně se zředí v poměru 1 : 100 pufrovaným solnám roztokem. Pokud se používá rozpouštědlo, musí být přítomno v konstantním objemu 1% (v/v) ve všech kulturách, tj. ve všech koncentracích testované látky i v negativních kontrolách.

Jako rozpouštědlo se doporučuje dimethylsulfoxid (DMSO) nebo ethanol (EtOH). Vhodná mohou být i další rozpouštědla s nízkou cytotoxicitou, například aceton, je však třeba vždy pečlivě zvážit jejich specifické vlastnosti, jako je případná reakce s testovanou látkou, potlačení fototoxického efektu nebo vychytávání radikálů.

Aby se napomohlo rozpouštění, dá se použít míchání resp. sonifikace, popřípadě ohřev na 37°C

1.7.1.6. Ozařování UV světlem / příprava

Světelný zdroj: volba správného světelného zdroje a správná filtrace je při testování fototoxicity klíčovým faktorem. Záření v UVA a ve viditelné oblasti je obvykle spojováno s fotosenzibilizací (7) (10), kdežto záření UVB je v tomto směru méně relevantní, je přímo vysoce cytotoxické, přičemž jeho cytotoxicita se při přechodu od 313 nm k 280 nm zvyšuje tisícinásobně. Mezi kritéria pro volbu světelného zdroje patří zásadní požadavek, aby emitoval vlnové délky, jež testovaná látka absorbuje, a aby byla světelná dávka (dosažitelná za přiměřenou dobu) postačující ke zjištění známých fotosenzibilizujících látek. Dále nesmějí být použité vlnové délky a dávky nepatřičně poškozující testovací systém - patří sem i vyzařování tepla (infračervená oblast).

Za optimální světelný zdroj se pokládají solární simulátory, jimiž se simuluje sluneční záření. Jako tyto simulátory se používají xenonové výbojky a dále (vysokotlaké) rtuťové halogenové výbojky - ty mají tu výhodu, že vyzařují méně tepla a jsou levnější, sluneční světlo však imitují hůře. Jelikož všechny solární simulátory emitují významné množství záření UVB, je třeba záření filtrovat tak, aby se toto vysoce cytotoxické záření dostatečně zeslabilo.

Pro test na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro je třeba použít spektrum záření, kde se složka UVB prakticky nevyskytuje (UVA:UVB ~ 20:1). Příklad spektrálního rozložení filtrovaného záření solárního simulátoru použitého při validační studii testu na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro je v práci (3).

Dozimetrie: intenzita světla (iradiance) se musí pravidelně před každým testem fototoxicity kontrolovat pomocí vhodného širokopásmového UV-metru, který musí být kalibrován pro daný zdroj. Funkčnost UV-metru je třeba kontrolovat, k čemuž se doporučuje použít druhý, referenční UV-metr téhož typu a kalibrace. Ideální je, když se v delších intervalech měří sektrální iradiance filtrovaného světelného zdroje a kontroluje se kalibrace širokopásmového UV-metru pomocí spektroradiometru; taková instrumentace ovšem vyžaduje kvalifikovanou obsluhu vyškoleného personálu.

Při validační studii bylo zjištěno, že dávka UVA záření 5 J/cm2 je pro buňky Balb/c 3T3 necytotoxická a přitom dostatečně silná, aby excitovala i slabě fototoxické látky. Aby se této dávky dosáhlo během 50 minut, musí být iradiance nastavena na 1,666 mW/cm2. Použije-li se jiná buněčná linie nebo jiný zdroj světla, musí se dávka záření UVA upravit tak, aby buňky nepoškozovala a byla dostatečná k průkazu standardních fototoxinů. Doba světelné expozice se vypočítává podle vzorce:

t(min) = dávka záření (J/cm2) x 100 (1J=1Ws)
---------------------------
záření (mW/cm2) x 60

1.7.2. Podmínky testu

Maximální koncentrace testované látky nemá převýšit hodnotu 100 μg/ml, neboť všechny fototoxické látky byly detekovány při koncentracích nižších, při vyšších koncentracích se zvyšuje četnost falešně pozitivních výsledků (13). Hodnota pH při nejvyšší koncentraci testované látky musí být přijatelná (oblast pH 6,5 - 7,8).

Rozsah koncentrací testované látky při použití světla (+UVA) a bez něj (-UVA) je třeba stanovit v rámci předběžných experimentů. Rozsah a postup koncentrační řady se zvolí tak, aby křivky závislosti koncentrace-odezva byly dostatečně podloženy experimentálními údaji. Používá se koncentrační geometrická řada (s konstantním faktorem ředění).

1.7.3. Popis postupu

1.7.3.1. První den

Připraví se suspenze 1 x 105 buněk/ml v kultivačním médiu. Do periferních jamek 96 jamkové mikrotitrační destičky pro tkáňové kultury se odpipetuje po 100 μl samotného média (= slepý pokus), do ostatních jamek se dávkuje po 100 μl buněčné suspenze o denzitě 1 x 105 buněk/ml (=1 x 104 buněk na jamku). Pro každou testovanou látku se připraví dvě destičky - jedna pro stanovení cytotoxicity (-UVA), druhá pro stanovení fototoxicity (+UVA).

Buňky se inkubují po dobu 24 hodin (7,5% CO2, 37°C), aby se vytvořil semikonfluentní monolayer. Tato inkubační doba umožňuje regeneraci a adherenci buněk a jejich exponenciální růst.

1.7.3.2. Druhý den

Po inkubaci se kultivační médium z buněk odstraní a promyje dvakrát objemem 150 μl EBSS/PBS na každou jamku. Přidá se 100 μl EBSS/PBS obsahujícího testovanou látku v příslušné koncentraci nebo jenom rozpouštědlo (negativní kontrola). Testovaná látka se přidává v osmi koncentracích. Buňky s testovanou látkou se inkubují v temnu po dobu 60 minut (7,5% CO2, 37°C).

Část testu s UVA (+UVA) se provádí tak, že se buňky za pokojové teploty ozařují po dobu 50 minut skrz víčko destičky s 96 jamkami zářením UVA o intenzitě 1,7 mW/cm2 (= dávka 5 /cm2). Aby nedocházelo ke kondenzaci vody pod víčkem, je třeba použít ventilátoru. Duplicitní destičky (-UVA) se po dobu 50 minut (= expoziční doba UVA) uchovávají za pokojové teploty v temném boxu.

Roztok se odstraní a jamky se promyjí dvakrát 150 μl EBSS/PBS. Poté se naplní kultivačním médiem a přes noc (18 - 22 hodin) se inkubují (7,5% CO2, 37°C).

1.7.3.3. Třetí den

Mikroskopické hodnocení

Buňky se prohlédnou pod mikroskopem s fázovým kontrastem. Zaznamenají se změny morfologie buněk způsobené cytotoxickým účinkem testované látky. Tato kontrol se doporučuje, aby se eliminovaly experimentální chyby, ale při vyhodnocování cytotoxicity nebo fototoxicity se tyto záznamy nepoužijí.

Test příjmu neutrální červeně (NR)

Buňky se promyjí objemem 150 μl předehřátého EBSS/PBS. Promývací roztok se odstraní jemným poklepem. Přidá se 100 μl média s NR a inkubuje se při 37°C ve zvlhčené atmosféře s 7,5% CO2 po dobu 3 hodin.

Po inkubaci se médium s NR odstraní a buňky se promyjí objemem 150 μl EBSS/PBS, jenž se pak zcela a důkladně odstraní (je také možno destičky zcentrifugovat v obrácené poloze).

Přidá se přesně 150 μl roztoku na uvolnění NR (čerstvě připravená směs ethanol/kyselina octová).

Mikrotitrační destičky se po dobu 10 minut rychle třepou na třepačce, dokud se NR z buněk nevyextrahuje a nevytvoří se homogenní roztok.

Na spektrofotometru se změří optická hustota extraktu NR při 540 nm za použití slepého pokusu jako srovnávacího roztoku. Údaje se uchovají ve vhodném formátu (např. ASCII) pro další analýzu.