6. Zkouška dvourozměrnou chromatografií na tenké vrstvě
Tato metoda dvourozměrné chromatografie vyžaduje použití dalších standardů a reakčních činidel.
6.1 Další standardy a činidla
6.1.1 β-naflol (β-N)
6.1.2 2-aminofenol (OAP)
6.1.3 3-aminofenol (MAP)
6.1.4 4-aminofenol (PAP)
6.1.5 2-nitro-l,4-fenylendiamin (2-NPPD)
6.1.6 4-nitro-l ,2-fenylendiamin (4-NOPD)
Připraví se 0,5 % (m/V) roztoky všech dalších standardů způsobem popsaným v bodě 3.21.
6.2 Další mobilní fáze
6.2.1 Ethylacetát - cyklohexan - 25 % roztok amoniaku (65 : 30 : 0,5, V/V/V)
6.3 Další detekční systém
Do vyvíjecí komory pro chromatografii na tenké vrstvě se vloží skleněná nádobka, přidají se asi 2 g krystalického jodu a komora se uzavře odpovídajícím víkem.
6.4 Chromatografie
6.4.1 Podle obrázku 6 se na desce pro chromatografii na tenké vrstvě (4.1.3) vyznačí na straně s adsorbentem dvě linky.
6.4.2 V dusíkové atmosféře (4.1.1) se nanese 1 až 4 μl extraktu (5.1) do základního bodu 1 (obr. 6), který leží asi 2 cm od obou okrajů. Množství extraktu závisí na intenzitě skvrn na chromatogramech podle bodu 5.2.
6.4.3 Mezi body 2 a 3 (obr. 6) se nanesou oxidační barviva identifikovaná nebo pokládaná za identifikovaná podle bodu 5.2 (vzdálenost mezi body je 1,5 cm). Nanáší se 2 μl každého referenčního roztoku - kromě DAP, který je nutno nanést v objemu 6 μl. Nanášení se provádí v atmosféře dusíku (6.4.2).
6.4.4 Postup podle bodu 6.4.3 se opakuje v základních bodech 4 a 5 (obr. 6) a deska se uchovává pod dusíkem až do zahájení vyvolávání chromatogramu (vzdálenost mezi body je 1,5 cm).
6.4.5 Chromatografická komora se propláchne dusíkem (3.8) a umístí se do ní vhodné množství mobilní fáze 3.22.2. Deska (6.4.4) se vloží do komory a vyvíjí se ve tmě v prvním vyvíjecím směru (obr. 6).
Vyvíjí se, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne linie vyznačené na desce (přibližně 13 cm).
6.4.6 Deska se z komory vyjme a umístí do jiného chromatografické komory, předem propláchnuté dusíkem, aby se vyvíjecí rozpouštědlo odpařovalo alespoň 60 minut.
6.4.7 Pomocí dělené zkumavky se do komory předem propláchnuté dusíkem (3.8) vnese vhodné množství mobilní fáze (6.2), do komory se vloží deska otočená o 90° (6.4.6) a chromatogram se vyvíjí ve druhém směru (opět ve tmě), dokud čelo rozpouštědla nedosáhne linie vyznačené na straně s adsorbentem. Deska se vyjme z komory a rozpouštědlo se nechá odpařit na vzduchu.
6.4.8 Deska se na 10 minut umístí do chromatografické komory obsahující páry jodu (6.3) a dvourozměrný chromatogram se interpretuje s využitím hodnot
R
f
a barev současně chromatografovaných standardů (hodnoty
R
f
a barvy skvrn jsou uvedeny v tabulce II).
Poznámka
Nejlepšího vybarvení skvrn se dosáhne tehdy, ponechá-li se po vyvíjení chromatogram v atmosféře par jódu po dobu půl hodiny.
6.4.9 Přítomnost oxidačních barviv nalezených podle bodu 6.4.8 je možno definitivně potvrdit opakováním postupu popsaného v bodech 6.4.1 až 6.4.8, kdy se v základním bodě 1 přes množství extraktu podle bodu 6.4.2 nanese 1 μl referenčních látek identifikovaných v bodě 6.4.8. Neobjeví-li se oproti chromatogramu získaného podle bodu 6.4.8 žádná jiná skvrna, je interpretace chromatogramu podle bodu 6.4.8 správná.
Tabulka II
Barvy skvrn standardů po chromatografii a vyvíjení parami jodu
+----------------------------+-------------------------------+
| Standardy | Barvy po vyvíjení parami jodu |
+----------------------------+-------------------------------+
| R | béžová |
| P | hnědá |
| α-N | fialová |
| β-N | světle hnědá |
| H | fialově hnědá |
| MPD | žlutavě hnědá |
| PPD | fialově hnědá |
| MTD | tmavě hnědá |
| PTD | žlutavě hnědá |
| DAP | tmavě hnědá |
| OAP | oranžová |
| MAP | žlutavě hnědá |
| PAP | fialově hnědá |
| 2-NPPD | hnědá |
| 4-NOPD | oranžová |
+----------------------------+-------------------------------+
Obrázek 6 - Schéma