5. Postup
5.1 Příprava vzorků k analýze
První 2 až 3 cm krému vytlačeného z tuby se odstraní.
Do centrifugační zkumavky (4.3) předem propláchnuté dusíkem se převede: 300 mg kyseliny askorbové se 3 g krému nebo 3 g homogenizované kapaliny.
Přidává se po kapkách 25 % amoniak (3.4) až pH dosáhne hodnoty 10. Doplní se na 10 ml 96 % ethanolem (3.3).
Homogenizuje se pod atmosférou dusíku (3.8), zazátkuje se a centrifuguje se po 10 minut při 4000 ot./min.
Použije se supernatant.
5.2 Chromatografie
5.2.1 Nanášení na desku
Pod atmosférou dusíku (3.8) se na chromatografickou desku (4.1.3) nanese po 1 μl každé shora uvedené referenční látky v devíti bodech vzdálených od sebe 1,5 cm podél linie vzdálené asi 1,5 cm od okraje desky.
Referenční látky se nanášejí v tomto uspořádání:
1 2 3 4 5 6 7 8 9
R P H PPD DAP PTD OPD OTD MPD
MTD α-N
Dále se v bodech 10 a 11 nanesou vždy 2 μl zkoumaných roztoků získaných podle bodu 5.1.
Deska se uchovává pod atmosférou dusíku (3.8) až do okamžiku, kdy je zahájeno vyvíjení chromatogramu.
5.2.2 Vyvíjení
Deska se vloží do komory předem propláchnuté dusíkem (3.8) a nasycené jedním ze čtyř rozpouštědel (3.22) a nechá se vyvíjet při laboratorní teplotě (20 až 25 °C) ve tmě, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne vzdálenosti asi 15 cm od startovací linie.
Deska se vyjme a usuší pod atmosférou dusíku (3.8) při laboratorní teplotě.
5.2.3 Vyvolání
Deska se postříká odpovídajícím detekčním činidlem uvedeným v bodě 3.23.
5.2.4 Kvalitativní stanovení
Porovnají se hodnoty
R
f
a barvy skvrn vzorku a chromatografovaných referenčních látek.
V tabulce 1 jsou uvedeny příklady hodnot
R
f
a barev skvrn pro jednotlivé látky v závislosti na použitém rozpouštědle a indikátoru.
Nejistý důkaz je někdy možno potvrdit metodou standardního přípravku.
5.2.5 Semikvantitativní odhad
Intenzita skvrn jednotlivých látek identifikovaných v bodě 5.2.4 se porovnává vizuálně s odpovídajícím rozsahem koncentrací standardních látek.
Při nadměrně vysoké koncentraci jedné nebo více látek nalezených ve vzorku se extrakt vzorku zředí a měření se opakuje.
Tabulka 1
Hodnoty R a barvy získané bezprostředně po vyvolání
f
+----------+-------------------------------------------+-----------------------------------------------------+
| Standard | Mobilní fáze | Mobilní fáze |
| (3.20) +-------------------------------------------+-----------------------------------------------------+
| | Hodnoty R | Výsledné barvy |
| | f | |
| +----------+----------+----------+----------+-----------+-------------+---------------+-----------+
| | (3.22.1) | (3.22.2) | (3.22.3) | (3.22.4) | Diazo | Ehrlich | Dimethylfenol | AgNO |
| | | | | | | | | 3 |
| | | | | | (3.23.1) | (3.23.2) | (3.23.3) | (3.23.4) |
+----------+----------+----------+----------+----------+-----------+-------------+---------------+-----------+
| OPD | 0,62 | 0,60 | 0,30 | 0,57 | světle | - | - | světle |
| | | | | | hnědá | | | hnědá |
+----------+----------+----------+----------+----------+-----------+-------------+---------------+-----------+
| MPD | 0,40 | 0,60 | 0,47 | 0,48 | fialově | žlutá | světle | světle |
| | | | | | hnědá *) | | hnědá | hnědá |
+----------+----------+----------+----------+----------+-----------+-------------+---------------+-----------+
| PPD | 0,20 | 0,50 | 0,30 | 0,48 | hnědá | jasně | fialová | šedá |
| | | | | | | červená *) | | |
+----------+----------+----------+----------+----------+-----------+-------------+---------------+-----------+
| OTD | 0,60 | 0,60 | 0,53 | 0,60 | hnědá *) | světle | světle | šedavě |
| | | | | | | oranžová | hnědá | hnědá |
+----------+----------+----------+----------+----------+-----------+-------------+---------------+-----------+
| MTD | 0,40 | 0,67 | 0,45 | 0,60 | červenavě | žlutá | hnědá | černá |
| | | | | | hnědá *) | | | |
+----------+----------+----------+----------+----------+-----------+-------------+---------------+-----------+
| PTD | 0,33 | 0,65 | 0,37 | 0,70 | hnědá | oranžová | fialová *) | šedá |
| | | | | | | | | |
+----------+----------+----------+----------+----------+-----------+-------------+---------------+-----------+
| DAP | 0,07 | - | 0 | 0,05 | hnědá *) | oranžová | fialová | hnědá |
| | | | | | | | | |
+----------+----------+----------+----------+----------+-----------+-------------+---------------+-----------+
| H | 0,50 | 0,35 | 0,80 | 0,20 | - | oranžová | fialová | černá *) |
| | | | | | | | | |
+----------+----------+----------+----------+----------+-----------+-------------+---------------+-----------+
| α-N | 0,690 | 0,80 | 0,90 | 0,75 | oranžově | - | fialová *) | černá |
| | | | | | hnědá | | | |
+----------+----------+----------+----------+----------+-----------+-------------+---------------+-----------+
| P | 0,37 | - | 0,67 | 0,05 | hnědá | velmi | velmi světle | hnědá *) |
| | | | | | | světle | hnědá | |
| | | | | | | fialová | | |
+----------+----------+----------+----------+----------+-----------+-------------+---------------+-----------+
| R | 0,50 | 0,37 | 0,80 | 0,17 | oranžová | světle | velmi světle | světle |
| | | | | | *) | fialová | hnědá | modrá |
+----------+----------+----------+----------+----------+-----------+-------------+---------------+-----------+
Poznámka:
1. OPD se ukazuje pouze slabě; musí se použít rozpouštědlo (3.22.3), aby se jasně odlišil od OTD.
2. *) Označuje nejlépe vyvolané barvy.