1.8.4 Popis postupu
1.8.4.1 První den
Připraví se suspenze
5
1 x 10
buněk/ml v kultivačním médiu. Do periferních jamek 96 jamkové mikrotitrační destičky pro tkáňové kultury se odpipetuje po 100 μl samotného média (= slepý pokus), do ostatních jamek se dávkuje po 100 μl buněčné suspenze o denzitě
5
1 x 10
buněk/ml
4
(= 1 x 10 buněk na jamku).
Pro každou testovanou látku se připraví dvě destičky - jedna pro stanovení cytotoxicity (-UVA), druhá pro stanovení fotocytotoxicity (+UVA).
Buňky se inkubují po dobu 24 hodin
(7,5 % CO , 37 °C),
2
aby se vytvořil semikonfluentní monolayer. Tato inkubační doba umožňuje regeneraci a adherenci buněk a jejich exponenciální růst.
1.8.4.2 Druhý den
Po inkubaci se kultivační médium z buněk odstraní a promyje dvakrát objemem 150 μl EBSS/PBS na každou jamku. Přidá se 100 μl EBSS/PBS obsahujícího testovanou látku v příslušné koncentraci nebo jenom rozpouštědlo (negativní kontrola). Testovaná látka se přidává v 8 koncentracích. Buňky s testovanou látkou se inkubují v temnu po dobu 60 minut
(7,5 % CO , 37 °C).
2
Část testu s UVA (+UVA) se provádí tak, že se buňky za pokojové teploty ozařují po dobu 50 minut skrz víčko destičky s 96 jamkami zářením UVA o intenzitě 1,7 mW/cm2 (= dávka 5 J/cm2). Aby nedocházelo ke kondenzaci vody pod víčkem, je třeba použít ventilátoru. Duplicitní destičky (-UVA) se po dobu 50 minut (= expoziční doba UVA) uchovávají za pokojové teploty v temném boxu.
Roztok se odstraní a jamky se promyjí dvakrát 150 μl EBSS/PBS. Poté se naplní kultivačním médiem a přes noc (18 - 22 hodin) se inkubují
(7,5 % CO , 37 °C).
2
1.8.4.3 Třetí den
Mikroskopické hodnocení
Buňky se prohlédnou pod mikroskopem s fázovým kontrastem. Zaznamenají se změny morfologie buněk způsobené cytotoxickým účinkem testované látky. Tato kontrola se doporučuje, aby se eliminovaly experimentální chyby, ale při vyhodnocování cytotoxicity nebo fototoxicity se tyto záznamy nepoužijí.
Test příjmu neutrální červeně (NR)
Buňky se promyjí objemem 150 μl předehřátého EBSS/PBS. Promývací roztok se odstraní jemným poklepem. Přidá se 100 μl média s NR a inkubuje se při 37 °C ve zvlhčené atmosféře s 7,5 %
CO po dobu 3 hodin.
2
Po inkubaci se médium s NR odstraní a buňky se promyjí objemem 150 μl EBSS/PBS, jenž se pak zcela a důkladně odstraní (je také možno destičky zcentrifugovat v obrácené poloze).
Přidá se přesně 150 μl roztoku na uvolnění NR (čerstvě připravená směs ethanol/kyselina octová).
Mikrotitrační destičky se po dobu 10 minut rychle třepou na třepačce, dokud se NR z buněk nevyextrahuje a nevytvoří se homogenní roztok.
Na spektrofotometru se změří optická hustota extraktu NR při 540 nm za použití slepého pokusu jako srovnávacího roztoku. Údaje se uchovají ve vhodném formátu (např. ASCII) pro další analýzu.
------------------------------------------------------------------
6) Směrnice Komise 2000/33/ES, kterou se po dvacáté sedmé přizpůsobuje technickému pokroku Směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 136 2000).