1.8.2 Příprava
1.8.2.1 Buňky
Při validační studii byla použita stabilizovaná buněčná linie myších fibroblastů Balb/c 3T3 klon 31, a to buď z ATCC nebo z ECACC; ta se proto doporučuje. Podle stejného protokolu se dají s úspěchem použít i jiné buňky nebo buněčné linie, pokud se kultivační podmínky upraví podle jejich specifických potřeb; je však třeba prokázat, že jsou stejně vhodné.
U buněk je třeba pravidelně kontrolovat, že nejsou kontaminovány mykoplazmaty, a smí se použít jen v případě, že je výsledek kontroly uspokojivý.
Jelikož citlivost buněk vůči UVA záření může s počtem pasáží narůstat, je třeba používat buňky Balb/c 3T3 z pasáže s nejnižším číslem, pokud možno nižším než 100. Citlivost buněk Balb/c 3T3 vůči UVA záření je třeba pravidelně kontrolovat, a to postupem kontroly jakosti popsaným v tomto metodickém návodu.
1.8.2.2 Média a kultivační podmínky
Pro rutinní pasážování buněk a během postupu je třeba používat vhodná kultivační média a inkubační podmínky. V případě buněk Balb/c 3T3 se jedná o DMEM (Dulbeccova modifikace Eagleova media) obohacený 10 % séra novorozených telat, 4 mM glutaminu, penicilinem a streptomycinem a o inkubaci ve vlhkém prostředí při teplotě
37 °C/7,5 % CO .
2
Je nezbytné, aby podmínky kultivace zajišťovaly buněčný cyklus v normálním historickém rozmezí pro dané buňky resp. buněčnou linii.
1.8.2.3 Příprava kultur
Buňky ze zmražených zásobních kultur se nasadí v příslušné hustotě v kultivačním médiu a minimálně jednou se před použitím v testu na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro pasážují.
Pro test fototoxicity se buňky nasadí v kultivačním médiu v takové hustotě, aby na konci testu (tj. kdy se stanovuje životaschopnost buněk 48 hodin po nasazení) nedošlo ke konfluenci (ke splynutí v souvislou, jednolitou vrstvu buněk). V případě buněk Balb/c 3T3 kultivovaných v destičkách s 96 jamkami se doporučuje hustota
4
1 x 10
buněk v jedné jamce.
Pro každou testovanou látku se buňky nasazují identicky na dvě destičky s 96 jamkami, které pak procházejí celým postupem za identických kultivačních podmínek, s výjimkou doby, kdy je jedna z destiček ozařována (+UVA/VIS) a druhá je uchovávána v temnu (-UVA/VIS).
1.8.2.4 Metabolická aktivace
Zatímco při všech testech in vitro pro posouzení genotoxického nebo karcinogenního potenciálu je obecným požadavkem použití metabolizujícího systému, není v případě fototoxikologie známa žádná látka, kde by k tomu, aby působila jako fototoxin in vivo nebo in vitro, bylo metabolické transformace zapotřebí. Nepokládá se proto ani za nutné, ani za vědecky odůvodněné, aby se tento test prováděl s nějakým metabolickým aktivačním systémem.
1.8.2.5 Testovaná látka/příprava
Testovaná látka musí být před použitím čerstvě připravena, ledaže údaje o její stabilitě prokazují, že se dá skladovat. Pokud je pravděpodobné, že by došlo k fotodegradaci, musí se příprava provádět pod červeným světlem.
Látka se rozpustí v pufrovaném solném roztoku, například v Earlově vyváženém solném roztoku (EBSS) nebo ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (phosphate buffered saline, PBS), který - aby nemohlo dojít k interferenci během ozařování - nesmí obsahovat žádné proteinové složky ani barevné indikátory pH, pohlcující světlo.
Pokud je testovaná látka ve vodě omezeně rozpustná, rozpustí se ve vhodném rozpouštědle v koncentraci stonásobně vyšší, než je požadovaná konečná koncentrace, a následně se zředí v poměru 1 : 100 pufrovaným solným roztokem. Pokud se používá rozpouštědlo, musí být přítomno v konstantním objemu 1 % (v/v) ve všech kulturách, tj. ve všech koncentracích testované látky i v negativních kontrolách.
Jako rozpouštědlo se doporučuje dimethylsulfoxid (DMSO) nebo ethanol (EtOH). Vhodná mohou být i další rozpouštědla s nízkou cytotoxicitou, například aceton, je však třeba vždy pečlivě zvážit jejich specifické vlastnosti, jako je případná reakce s testovanou látkou, potlačení fototoxického efektu nebo vychytávání radikálů.
Aby se napomohlo rozpouštění, dá se použít míchání resp. sonifikace, popřípadě ohřev na 37 °C.
1.8.2.6 Ozařování UV světlem/příprava
Světelný zdroj: volba správného světelného zdroje a správná filtrace je při testování fototoxicity klíčovým faktorem. Záření v UVA a ve viditelné oblasti je obvykle spojováno s fotosenzibilizací, 6) kdežto záření UVB je v tomto směru méně relevantní, je přímo vysoce cytotoxické, přičemž jeho cytotoxicita se při přechodu od 313 nm k 280 run zvyšuje tisícinásobně. 6) Mezi kritéria pro volbu světelného zdroje patří zásadní požadavek, aby emitoval vlnové délky, jež testovaná látka absorbuje, a aby byla světelná dávka (dosažitelná za přiměřenou dobu) postačující ke zjištění známých fotosenzibilizujících látek. Dále nesmějí být použité vlnové délky a dávky nepatřičně poškozující testovací systém - patří sem i vyzařování tepla (infračervená oblast).
Za optimální světelný zdroj se pokládají solární simulátory, jimiž se simuluje sluneční záření. Jako tyto simulátory se používají xenonové výbojky a dále (vysokotlaké) rtuťové halogenové výbojky - ty mají tu výhodu, že vyzařují méně tepla a jsou levnější, sluneční světlo však imitují hůře. Jelikož všechny solární simulátory emitují významné množství záření UVB, je třeba záření filtrovat tak, aby se toto vysoce cytotoxické záření dostatečně zeslabilo.
Pro test na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro je třeba použít spektrum záření, kde se složka UVB prakticky nevyskytuje (UVA:UVB ~ 20: 1). Příklad spektrálního rozložení filtrovaného záření solárního simulátoru použitého při validační studii testu na fototoxicitu 3T3 NRU in vitro byl publikován. 6)
Dozimetrie: intenzita světla (iradiance) se musí pravidelně před každým testem fototoxicity kontrolovat pomocí vhodného širokopásmového UV-metru, který musí být kalibrován pro daný zdroj. Funkčnost UV-metru je třeba kontrolovat, k čemuž se doporučuje použít druhý, referenční UV-metr téhož typu a kalibrace. Ideální je, když se v delších intervalech měří spektrální iradiance filtrovaného světelného zdroje a kontroluje se kalibrace širokopásmového UV-metru pomocí spektroradiometru; taková instrumentace ovšem vyžaduje kvalifikovanou obsluhu vyškoleného personálu.
Při validační studii bylo zjištěno, že dávka UVA záření 5 J/cm2 je pro buňky Balb/c 3T3 necytotoxická a přitom dostatečně silná, aby excitovala i slabě fototoxické látky. Aby se této dávky dosáhlo během 50 minut, musí být iradiance nastavena na 1,666 mW/cm2. Použije-li se jiná buněčná linie nebo jiný zdroj světla, musí se dávka záření UVA upravit tak, aby buňky nepoškozovala a byla dostatečná k průkazu standardních fototoxinů. Doba světelné expozice se vypočítává podle vzorce:
dávka světelného záření (J/cm2 x 1000) (1 J = 1 W.s)
t (min) = ----------------------------------------
intenzita ozáření (mW/cm2 x 60)