1.5.3 Pozorování
Doba pozorování je nejméně 90 dní. Zvířata v satelitní skupině určená k následnému pozorování se ponechají vhodnou dobu bez aplikace, aby se posoudilo, zda nastalo zotavení nebo zda toxické účinky přetrvávají.
Běžné klinické pozorování je třeba provádět nejméně jednou denně, nejlépe vždy ve stejnou denní dobu, v době očekávaného maximálního účinku. Klinický stav zvířat se zaznamenává. Nejméně dvakrát denně, obvykle na začátku a na konci každého dne, se provede prohlídka u všech zvířat za účelem zjištění úmrtí a příznaků onemocnění.
Alespoň jednou před první aplikací látky a dále jednou týdně se provede důkladné klinické pozorování všech zvířat za účelem intraindividuálního srovnání. Pozorování je třeba provádět mimo chovnou klec, nejlépe ve standardním pozorovacím prostoru a pokaždé ve stejnou dobu. Je třeba zajistit, aby se podmínky pozorování měnily minimálně. Příznaky toxicity je třeba pečlivě zaznamenávat, včetně doby nástupu, stupně a trvání. Pozorování zahrnuje přinejmenším změny kůže, srsti, očí a sliznic, přítomnost sekretů a exkretů a změny autonomních funkcí (slzení, piloerekce, velikost zornic, poruchy dýchání). Zaznamenávají se změny chůze a drženi těla, dále reakce na manipulaci, přítomnost klonických a/nebo tonických pohybů, stereotypů (např. nadměrné čištění, opakované kroužení) nebo bizarní chování.
Oftalmologické vyšetření oftalmoskopem nebo rovnocenným přístrojem se má provést před podáváním testované látky a na konci studie nejlépe u všech zvířat, ale nejméně u skupiny s nejvyšší dávkou a u kontrolní skupiny. Zjistí-li se oční změny, vyšetří se všechna zvířata.
1.5.3.1 Tělesná hmotnost a spotřeba potravy/vody
Všechna zvířata se váží nejméně jednou týdně. Příjem potravy se zjišťuje nejméně jednou týdně. Provádí-li se aplikace v pitné vodě také nejméně jednou týdně se zaznamená spotřeba vody. Ke spotřebě vody je potřeba přihlédnout ve studiích, kdy se podává testovaná látka v potravě nebo sondou, během nichž může dojít ke změně příjmu tekutin.
1.5.3.2 Hematologie a klinická biochemie
Krev se odebírá z určeného místa a skladuje se za vhodných podmínek. Na konci testování se vzorky odebírají těsně před utracením nebo při něm.
Z odběrů krve na počátku testování a pak v měsíčních intervalech nebo v polovině studie a poté i na konci se provádí následující hematologická vyšetření: stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počet erytrocytů, celkový a diferenciální počet leukocytů, počet destiček, test na srážlivost krve, stanoví se protrombinový a trombinový čas.
Biochemická analýza zaměřená na posouzení závažných toxických účinků na tkáně, zvláště na ledviny a játra, se provede z krevních vzorků odebraných každému zvířeti na počátku studie a v měsíčních intervalech nebo v polovině studie a na konci studie.
Je vhodné stanovit koncentraci elektrolytů, metabolismus cukrů, funkce jater a ledvin. Výběr specifických testů je určen pozorováním mechanizmu účinku látky. Před odběrem krve se doporučuje nechat zvířata nalačno po dobu vhodnou pro daný druh. Doporučuje se stanovení vápníku, fosforu, chloridů sodíku, draslíku, glykémie nalačno, alaninaminotransferázy, aspartátaminotransferáry, omitindekarboxylázy, gamaglutamyltranspeptidázy, dusíku močoviny, albuminu, kreatininu, celkového bilirubinu a celkové bílkoviny v séru.
Minimálně na počátku, v polovině a na konci studie provést vyšetření moči z časově definovaného sběru. Hodnotí se následující parametry: vzhled, objem, osmolalita nebo specifická hmotnost, pH, bílkoviny, glukóza a krev/krvinky. V případě potřeby se mohou použít další analýzy pro studium širšího spektra účinků.
Dále je třeba uvážit stanovení nespecifických indikátorů poškození tkání. Mezi další testy, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení lipidů, hormonů, acidobazické rovnováhy, methemoglobinu a aktivity cholinesterázy. Je-li zapotřebí na základě pozorovaných účinků rozšířit zkoumání, lze přidat i další klinicko-biochemické testy. Účelnost těchto vyšetření se posuzuje podle příslušnosti do určitých skupin látek nebo případ od případu.
Obecně je třeba postupovat pružně, brát v úvahu použitý živočišný druh a pozorované či očekávané účinky dané látky.
1.5.3.3 Pitva
U všech zvířat použitých ve studii se provede podrobná pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Játra s žlučníkem, ledviny, nadledviny, varlata, nadvarlata, vaječníky, děloha, štítná žláza (s příštítnými tělísky), brzlík, slezina, mozek a srdce všech zvířat (kromě těch, která byla nalezena mrtvá nebo usmrcena průběžně) se pečlivě očistí od ulpělých tkání a co nejdříve po sekci se ve vlhkém stavu zváží, aby nedošlo k vyschnutí.
Následující tkáně je třeba přechovávat ve vhodném fixačním médiu pro daný typ tkáně a plánovaná následná histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickými lézemi, mozek (reprezentativní oblasti včetně předního mozku, mozečku a prodloužené míchy), mícha (ve třech úrovních: krční, střední hrudní a lumbální), hypofýza, oči, štítná žláza, příštítná tělíska, brzlík, jícen, slinné žlázy, žaludek, tenké a tlusté střevo (včetně Pleyerových plátů), játra, žlučník, slinivka břišní, ledviny, nadledviny, slezina, srdce, průdušnice a plíce, aorta, pohlavní žlázy, děloha, přídatné pohlavní orgány, samičí mléčná žláza, prostata, močový měchýř, lymfatické uzliny (přednostně jedna pro oblast aplikace a jedna vzdálená pro pokrytí systémových účinků), periferní nerv (n. ischiadicus nebo n. tibialis) nejlépe v blízkosti svalu, řez kostní dřeně (a/nebo čerstvý nátěr z nasáté kostní dřeně) a kůže. Podle klinických nebo jiných nálezů je možno zkoumat i další tkáně. Každý orgán, který by mohl být cílovým orgánem pro působení testované látky, je třeba konzervovat.
1.5.3.4 Histopatologická vyšetření
U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší dávkou objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami.
Všechny makroskopické léze je třeba vyšetřit.
U zvířat satelitních skupin, pokud byly do studie zařazeny, je třeba provést histopatologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.
------------------------------------------------------------------
10) Vyhláška č. 207/2004 Sb., o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat.