1.5.3 Popis postupu
Po aplikaci prostředku, ochraňujícího před úmrtím na následky akutního cholinergního účinku, je testovaná látka podána v jediné dávce.
1.5.3.1 Všeobecné pozorování
Pozorování má začít okamžitě po podání látky. Všechny slepice se pečlivě pozorují několikrát v průběhu prvních 2 dnů a pak aspoň jednou denně po dobu 21 dní nebo dokud nebudou utraceny podle plánu. Veškeré příznaky toxicity se zaznamenávají, včetně nástupu, typu, stupně a trvání abnormálního chování. Ataxie se hodnotí podle nejméně čtyřstupňové stupnice a zaznamenává se paréza. Nejméně dvakrát týdně se slepice vykazující patologické změny vyjmou z klecí a vystaví nucené motorické aktivitě jako např. vystupování po žebříku, aby se usnadnilo posouzení minimálních toxických účinků. Umírající zvířata a zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky utrpení a bolesti je třeba vyřadit, humánním způsobem utratit a pitvat.
1.5.3.2 Tělesná hmotnost
Všechny slepice se zváží těsně před podáním testované látky a pak aspoň jednou týdně.
1.5.3.3 Biochemie
6 slepic náhodně vybraných z každé testované a kontrolní skupiny s vehikulem a 3 slepice z pozitivní kontrolní skupiny (je-li skupina použita) se usmrtí v prvních dnech po aplikaci látky. Pro analýzu inhibice NTE se vyjmou mozek a lumbální mícha. Je vhodné vypreparovat také nervus ischiadicus a analyzovat jeho tkáň na inhibici NTE. Běžně se usmrcují 3 slepice z kontrolní a každé testované skupiny po 24 hodinách a další tři po 48 hodinách, 3 slepice z pozitivní kontrolní skupiny se usmrcují pouze po 24 hodinách. Jestliže pozorování klinických příznaků naznačuje, že toxická látka se v organismu pohybuje velmi pomalu (hodnotí se nástup cholinergních příznaků), pak je výhodnější odebrat vzorky tkáně dvakrát ze 3 zvířat, a to mezi 24 až 72 hodinami po podání látky.
U těchto vzorků tkáně se případně provede také analýza acetylcholinesterázy (AChE). In vivo může však nastat spontánní reaktivace AChE, což může vést k podcenění látky jako inhibitoru AChE.
1.5.3.4 Pitva
Pitva všech zvířat (plánovaně usmrcených i utracených pro špatný celkový stav) zahrnuje makroskopické posouzení stavu mozku a míchy.
1.5.3.5 Histopatologické vyšetření
Nervová tkáň z přeživších zvířat (nepoužitých pro biochemické studie) se histologicky vyšetří. Tkáně se fixují in situ za použití perfuzních technik. Odebírá se: mozeček (střední podélný řez), prodloužená mícha, mícha - řezy míchy se provádějí v horní krční části, střední hrudní a lumbosakrální, z periferních nervů se odebírá distální část z n. tibialis (a jeho větve k m.gastrocnemius) a z n. ischiadicus. Řezy se barví specifickými barvivy na myelin a axony.
------------------------------------------------------------------
10) Vyhláška č. 207/2004 Sb., o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat.