1.5.1.3 Popis postupu
1.5.1.3.1 Indukce
Den 0 - Testovaná skupina
Následující 3 dvojice subkutánních injekcí, každá po 0,1 ml, se podají do lopatkové oblasti zbavené srsti symetricky podle střední linie:
Injekce 1: Freundovo kompletní adjuvans (FCA) smíšené s vodou
nebo fyziologickým roztokem v objemovém poměru 1:1;
Injekce 2: testovaná látka ve vhodném vehikulu ve zvolené
koncentraci;
Injekce 3: testovaná látka ve zvolené koncentraci připravená ve
směsi FCA s vodou nebo fyziologickým roztokem v
objemovém poměru 1 : 1.
Pro injekci 3 se látky ve vodě rozpustné rozpustí před smísením s FCA ve vodné fázi. Látky rozpustné v lipidech nebo látky nerozpustné se rozptýlí v nezředěném FCA. Konečná koncentrace testované látky pro injekci 3 má být stejná jako pro injekci 2.
Injekce 1 a 2 se aplikují blízko sebe a co nejblíže hlavě, zatímco injekce 3 směrem ke kaudální části testovací plochy.
Den 0 - Kontrolní skupina
Následující 3 dvojice subkutánních injekcí, každá po 0,1 ml, se podají do stejných míst jako u testovaných zvířat:
Injekce 1: Freundovo kompletní adjuvans (FCA) smíšené s vodou
nebo fyziologickým roztokem v objemovém poměru 1 : 1;
Injekce 2: neředěné vehikulum;
Injekce 3: Směs vehikula (50 %, váha/objem) se směsí FCA/vody
nebo fyziologického roztoku v poměru 1 : 1
(objem/objem).
5. - 7. den - Testované a kontrolní skupiny
Přibližně dvacet čtyři hodin před lokální indukční aplikací, jestliže látka není dráždivá pro kůži, se na testovací plochu po důkladném ostříhání případně oholení natře 0,5 ml 10 % laurylsulfátu sodného ve vazelíně, za účelem navození místního podráždění.
6. - 8. den - Testovaná skupina
Testovací plocha se zbaví srsti. Testovanou látkou ve vhodném vehikulu je napuštěn filtrační papír (2 x 4 cm), který se pak přiloží na testovací plochu a fixuje pomocí okluzívního obvazu na dobu 48 hodin. Výběr vehikula se řídí odbornými důvody; pevné látky jsou jemně rozetřeny a převedeny do vhodného vehikula; kapaliny lze aplikovat přímo.
6. - 8. den - Kontrolní skupina
Testovací plocha se znovu zbaví srsti. Samotné vehikulum se nanese a zafixuje podobně jako u exponované skupiny na dobu 48 hodin.
1.5.1.3.2 Provokace
20. - 22. den - Testované a kontrolní skupiny
Boky exponovaných i kontrolních zvířat jsou zbaveny srsti. Na jeden bok zvířete je aplikována testovaná látka v plátku nebo v komůrce a na druhý bok se stejným způsobem aplikuje pouze vehikulum (pokud je to třeba). Plátky se pomocí okluzívního obvazu udržují v kontaktu s kůží po 24 hodiny.
1.5.1.3.3 Pozorování a vyhodnocení: testované a kontrolní skupiny
- přibližně 21 hodin po odstranění náplasti se provokační plocha vyčistí, důkladně ostříhá případně oholí a v případě potřeby depiluje;
- přibližně po dalších třech hodinách (přibližně 48 hodin od začátku aplikace provokační dávky) se pozoruje kožní reakce a zaznamenává se podle stupnice uvedené v dodatku;
- přibližně 24 hodin po tomto pozorování se provede druhé pozorování a záznam reakce kůže (72 hodin).
Doporučuje se systém "slepého odečtu" u testovaných i kontrolních zvířat, kdy pozorující osoba neví, které zvíře bylo senzibilizováno a které je kontrolní.
Pokud je k vyjasnění výsledků nutná druhá provokace (tj. opakovaná provokace), provede se přibližně o týden později, v případě potřeby znovu s kontrolní skupinou s vehikulem. Opakovanou provokaci lze také provést na původní kontrolní skupině.
Všechny kožní reakce a neobvyklé nálezy, včetně celkových reakcí, které jsou důsledkem indukčních a provokačních postupů se zaznamenávají podle stupnice Magnussona/Klígmana v tabulce č. 8. K objasnění sporných nálezů je možno použít dalších technik, jako např. histopatologického vyšetření nebo měření tlouštíky kožních řas.