1.4.3 Experimentální podmínky
1.4.3.1 Pokusná zvířata
V pokusech se upřednostňují potkani, ale lze použít i jiný druh hlodavců, např. myši. Použijí se mladá zdravá zvířata z běžně užívaných laboratorních kmenů. Samice musí být nulipary a nesmí být březí. Aplikace by měla začít co nejdříve po odstavení a dříve než zvířata dosáhnou stáří devíti týdnů. Na začátku studie má být variační rozpětí hmotnosti zvířat minimální; pro každé pohlaví zvlášť by nemělo překročit ± 20 % střední hodnoty. Je-li studie předběžnou studií pro dlouhodobou studii chronické toxicity, měla by se v obou studiích používat zvířata stejného kmene a stejného původu.
1.4.3.2 Počet a pohlaví
Pro každou hladinu dávek se použije nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců). Pokud se zvířata budou usmrcovat v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou usmrcena před koncem pokusu. Na základě dřívějších znalostí o testované chemické látce nebo jí blízce příbuzné látce je třeba zvážit i přidání další (satelitní) skupiny zvířat 10 (5 zvířat každého pohlaví) do kontrolní skupiny a do skupiny s nejvyšší dávkou, aby se po ukončení aplikace mohlo posoudit, zda jsou případné účinky vratné nebo trvalé. Trvání tohoto následného pozorování se stanoví s ohledem na pozorované účinky.
1.4.3.3 Úrovně dávek
Neprovádí-li se limitní test (viz 1.4.3.4), použijí se nejméně tři úrovně dávek a souběžná kontrola. Úrovně dávek mohou vycházet z výsledků studií při opakované aplikaci nebo orientačních studií zaměřených na zjištění rozsahu účinných dávek a měly by zohledňovat všechny existující toxikologické a toxikokinetické údaje o testované látce nebo o příbuzných látkách. Nebrání-li tornu fyzikálně-chemická povaha či biologické účinky testované látky, má nejvyšší hladina dávky vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo velké utrpení. Další hladiny dávek, mají být voleny tak, aby vyvolaly toxické účinky odstupňované podle dávky a aby u nejnižší hladiny nebyly pozorovány nepříznivé účinky (NOAEL). Často je pro odstupňování dávek optimální dvoj- až čtyřnásobný poměr mezi dávkami; je vhodnější přidat čtvrtou experimentální skupinu, než mít intervaly mezi dávkami příliš široké (např. více než 6 - 10násobek).
Kontrolní skupině se nepodává žádná látka nebo, používá-li se vehikulum, je kontrolní skupině podáváno vehikulum. S výjimkou aplikace testované látky se zachází se zvířaty v kontrolní skupině stejně jako s pokusnými. Je-li použito vehikulum, podává se kontrolní skupině v nejvyšším použitém objemu. Podává-li se testovaná látka v potravě a způsobuje-li omezení příjmu potravy, doporučuje se použít paralelně skupinu se stejným omezením potravy, aby se odlišil vliv snížení příjmu potravy nechutenstvím od toxikologických změn.
Má se přihlédnout i k následujícím vlastnostem vehikula a ostatních aditiv: vliv na vstřebávání, distribuci, metabolismus nebo retenci testované látky; vliv na chemické vlastnosti testované látky, které mohou změnit její toxicitu; vliv na spotřebu potravy, vody nebo na nutriční stav zvířat.
1.4.3.4 Limitní test
Pokud test provedený níže popsanou metodou na dávkové úrovni
-1
1000 mg.kg
tělesné hmotnosti nebo vyšší neukáže pozorovatelné nepříznivé účinky a pokud se na základě údajů o látkách s podobnou strukturou nepředpokládá toxicita, není nutné provést kompletní studii se třemi úrovněmi dávek. Tento limitní test se neprovádí, naznačují-li údaje o expozici lidí použití vyšších dávek.