1.4.2 Postup zkoušky
1.4.2.1 Aplikace zkoušené látky
Zkoušená látka se aplikuje každému pokusnému zvířeti do spojivkového vaku jednoho oka tak, že se spodní víčko lehce odchlípne od oční bulvy. Víčka se pak asi na jednu sekundu lehce přidrží u sebe, aby nedošlo ke ztrátě látky. Druhé oko, do kterého se látka neaplikuje, slouží jako kontrola.
1.4.2.2 Výplach
Oči pokusných zvířat se do 24 h po instilaci zkoušené látky nevyplachují, s výjimkou pevných látek (viz část 1.4.2.3.2) a v případě okamžitých leptavých nebo dráždivých účinků. Použití satelitní skupiny pokusných zvířat k vyšetření vlivu výplachu očí se nedoporučuje, pokud to není vědecky odůvodněno. Je-li satelitní skupina nezbytná, použijí se dva králíci. Podmínky výplachu se podrobně zdokumentují, např. doba výplachu, složení a teplota promývacího roztoku, trvání, objem a rychlost aplikace.
1.4.2.3 Úroveň dávek
1.4.2.3.1 Zkoušení kapalin
Při zkoušení kapalin se použije dávka 0,1 ml. K instilaci látky přímo do oka by se neměly používat aerosolové rozstřikovače s čerpadlem. Před instilací 0,1 ml do oka by se měla tekutina z rozstřikovače vypudit a shromáždit do nádobky.
1.4.2.3.2 Zkoušení pevných látek
Při zkoušení pevných látek, past a zrnitých látek se použije objem 0,1 ml nebo hmotnost nejvýše 100 mg. Zkoušená látka se rozemele nájemný prášek. Objem pevného materiálu se stanoví až po opatrném zhutnění, např. poklepáním odměrnou nádobkou. Pokud se pevná zkoušená látka z oka pokusného zvířete neodstranila pomocí fyziologických mechanismů do doby prvního pozorování po 1 h po aplikaci, lze oko vypláchnout fyziologickým roztokem nebo destilovanou vodou.
1.4.2.3.3 Zkoušení aerosolů
Před instilací látek do oka se doporučuje zachytit látky obsažené v rozstřikovačích nebo aerosolech do nádobky. Jedinou výjimkou jsou látky obsažené v aerosolové nádobce pod tlakem, které z důvodu odpařování zachytit nelze. V takových případech se oko podrží otevřené a látka se do oka aplikuje vstříknutím trvajícím jednu sekundu ze vzdálenosti 10 cm přímo před okem. Vzdálenost se může podle tlaku v rozprašovači a jeho obsahu lišit. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození oka tlakem z rozprašovače. V příslušných případech může být nutné vyhodnotit potenciál "mechanického" poškození oka v důsledku rozprašovacího tlaku.
Dávku aerosolu lze odhadnout na základě této simulované zkoušky: látka se nastříká na odvažovací papír skrz otvor o velikosti králičího oka, přičemž tento otvor se nachází bezprostředně před papírem. Na základě zvýšení hmotnosti papíru se odhadne množství látky, která se vstříkne do oka. U těkavých látek lze dávku odhadnout pomocí zvážení odběrové nádobky před odstraněním zkoušené látky a po jejím odstranění.
1.4.2.4 Počáteční zkouška (zkouška dráždivých/leptavých účinků na oči in vivo na jednom pokusném zvířeti)
Jak je uvedeno ve strategii postupného zkoušení (viz tabulka 10), důrazně se doporučuje, aby byla zkouška in vivo provedena nejprve na jednom pokusném zvířeti.
Pokud výsledky této zkoušky naznačují, že látka má leptavé nebo vysoce dráždivé účinky na oči při použití popsaného postupu, další zkoušení dráždivých účinků na oči se neprovede.
1.4.2.5 Lokální anestetika
V jednotlivých případech lze použít lokální anestetika. Pokud analýza průkaznosti výsledků naznačuje, že látka může způsobit bolest, nebo pokud počáteční zkoušky ukazují, že se objeví bolestivá reakce, lze před instilací zkoušené látky použít lokální anestetika. Typ, koncentraci a dávku lokálního anestetika je třeba pečlivě zvolit, aby bylo zajištěno, že v důsledku jeho použití nedojde k odlišným reakcím na zkoušenou látku. Podobně se musí znecitlivit i kontrolní oko.
1.4.2.6 Potvrzující zkouška (zkouška dráždivých účinků na oči in vivo na dalších pokusných zvířatech)
Pokud během počáteční zkoušky není pozorován leptavý účinek, měla by se dráždivá nebo negativní reakce potvrdit na maximálně dalších dvou pokusných zvířatech. Pokud je během počáteční zkoušky pozorován značný leptavý účinek, který naznačuje možný silný (nevratný) účinek v potvrzující zkoušce, doporučuje se provést potvrzující zkoušku metodou postupného zkoušení na jednom pokusném zvířeti spíše než exponováním dalších dvou pokusných zvířat současně. Pokud se u druhého pokusného zvířete projeví leptavé nebo vysoce dráždivé účinky, ve zkoušce se nepokračuje. K potvrzení slabých nebo mírných dráždivých reakcí může být nutné použít další pokusná zvířata.
1.4.2.7 Doba pozorování
Doba pozorování by měla být dostatečně dlouhá, aby bylo možné plně zhodnotit míru a vratnost pozorovaných účinků. Zkouška by však měla být ukončena kdykoliv v okamžiku, kdy pokusné zvíře vykazuje přetrvávající příznaky značné bolesti nebo utrpení 7a). Za účelem určení vratnosti účinků by se pokusná zvířata měla obvykle pozorovat 21 dnů po podání zkoušené látky. Pokud je vratnost pozorována před uplynutím 21 dnů, zkouška by se měla v tomto okamžiku ukončit.
1.4.2.7.1 Klinická pozorování a hodnocení očních reakcí
Oči se vyšetří po 1, 24, 48 a 72 h po podání zkoušené látky. Jakmile se získají konečné informace, nemělo by zkoušení na pokusných zvířatech probíhat déle, než je nezbytné. Pokusná zvířata se známkami přetrvávajících prudkých bolestí nebo utrpení se neprodleně humánně utratí a látka se odpovídajícím způsobem vyhodnotí. Humánně se utratí ta pokusná zvířata, u nichž došlo po instilaci k těmto očním lézím: perforace rohovky nebo výrazné zvředovatění rohovky včetně stafylomu; krev v přední komoře oční; zákal rohovky stupně 4 přetrvávající 48 h; absence reakce na osvit (reakce duhovky stupně 2) přetrvávající 72 h; zvředovatění spojivkové membrány; nekróza spojivek nebo slzné žlázy; nebo odlupování nekrotické hmoty. Tento postup je dán nevratností takových lézí.
Pokusná zvířata, u nichž oční leze nevzniknou, nelze utratit dříve než 3 dny po instilaci. Pokusná zvířata s mírnými až středními lézemi se pozorují, dokud leze nevymizí, nebo po 21 dnů, po jejichž uplynutí se studie ukončí. Po 7, 14 a 21 dnech se provádí pozorování, aby se určil stav lézí a jejich vratnost nebo nevratnost.
Stupeň reakce oka (spojivek, rohovky a duhovky) je třeba zaznamenat při každém vyšetření (tabulka 11). Uvedou se také jakékoli jiné oční leze (např. panus, zbarvení) nebo nežádoucí systémové účinky.
Vyšetřování reakcí lze usnadnit použitím binokulární lupy, ruční štěrbinové lampy, očního mikroskopu nebo jiných vhodných zařízení. Po zaznamenání pozorování po 24 h mohou být oči pokusných zvířat dále vyšetřeny fluoresceinem.
Hodnocení očních reakcí je nevyhnutelně subjektivní. S cílem podporovat harmonizaci hodnocení očních reakcí a napomáhat zkušebním laboratořím a těm, kdo provádějí a interpretují pozorování, musí být zaměstnanci provádějící pozorování odpovídajícím způsobem kvalifikováni pro práci s používaným systémem vyhodnocování.
------------------------------------------------------------------
7a) Směrnice Komise 2004/73/ES, kterou se po dvacáté deváté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (L 152 2004).
10) Vyhláška č. 207/2004 Sb., o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat.