1.3.3 Popis postupu
Zvířata se exponují testované látce denně, 5 - 7 dnů v týdnu, po dobu 28 dnů. Zvířata v satelitních skupinách, která jsou určena k následnému pozorování, jsou pozorována dalších 14 dnů bez aplikace, k posouzení zotavení z otravy nebo přetrvávání toxických účinků. Teplota během experimentu má být 22 °C ± 3 °C. Relativní vlhkost má být mezi 30 % a 70 %, s výjimkou případů, kde to není možné (např. experimenty s aerosoly). Udržování mírného podtlaku uvnitř komory (≤ 5mm vodního sloupce) zabrání unikání testované látky do okolí. Během expozice se nepodává potrava ani voda.
Používá se dynamický inhalační systém s vhodnou analytickou kontrolou koncentrace. Doporučuje se provést předběžný pokus pro získání potřebných koncentrací. Rychlost průtoku vzduchu je třeba nastavit tak, aby podmínky v celém expozičním boxu byly stejné. Systém musí zaručovat, že stabilních podmínek expozice bude dosaženo co nejrychleji.
Měření nebo monitorování podmínek expozice:
a) Měření průtoku vzduchu (kontinuálně).
b) Skutečná koncentrace studované látky se měří v dýchací zóně. Během jedné expozice se nemá koncentrace odchylovat od střední hodnoty o více než ± 15 %. U některých prachů a aerosolů, kde této úrovně regulace není možné dosáhnout, se připouští větší rozsah kolísání. Po celou dobu trvání experimentu mají být koncentrace tak stabilní, jak je to prakticky možné. Pokud se týká částic a aerosolů, měří se distribuce velikosti částic týdně v každé testované skupině.
c) Teplota a vlhkost vzduchu kontinuálně.
Během expozice a po jejím skončení se pozorování provádějí a zaznamenávají systematicky; každé zvíře má svůj individuální protokol. Všechna zvířata je třeba denně pozorovat na příznaky toxických účinků a zaznamenávat jejich výskyt, stupeň a trvání. Pozorování zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat se zaznamenávají týdně. Doporučuje se zaznamenávat týdně i spotřebu potravy. Je třeba zajistit pravidelné prohlížení zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení.
Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Zvířata v agonii, ve značném stresu či trpící bolestí je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.
Na konci pokusu se u všech zvířat včetně kontrolních provedou následující vyšetření:
1. Hematologické vyšetření má zahrnovat alespoň stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů a srážlivosti krve.
2. Biochemická analýza krve: k posouzení funkce jater a ledvin stanovit alespoň jeden z těchto parametrů: alaninaminotransferáza v séru (dříve známá jako glutamát-pyruvát-transamináza), aspartátaminotransferáza séra (dříve známá jako glutamát-oxalacetát-transamináza), dusík močoviny, albumin, kreatinin, celkový bilirubin a celkové bílkoviny v séru.
Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení: vápníku, fosforu, chloridů, sodíku, draslíku, glukózy nalačno, lipidů, hormonů, acidobazické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterázy.
Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků.
1.3.3.1 Pitva
U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva. Aspoň játra, ledviny, nadledviny, plíce a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání. Orgány a tkáně (dýchací systém, játra, ledviny, slezina, varlata, nadledviny a srdce, i všechny orgány s makroskopickými změnami nebo změnami velikosti) je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na pozdější histopatologická vyšetření. Plíce je třeba vyjmout bez poškození, zvážit a fixovat vhodným mediem, tak aby se zachovala struktura.
1.3.3.2 Histopatologické vyšetření
U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší koncentrace, a u zvířat kontrolní skupiny, je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší koncentrací objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami. U zvířat satelitních skupin je třeba provést histologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.
------------------------------------------------------------------
10) Vyhláška č. 207/2004 Sb., o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat.