1.2.3 Vlastní experiment
1.2.3.1 Příprava kultur
Stabilizovaná buněčná linie se připravuje ze zásobní kultury (trypsinací nebo setřepáním buněk z povrchu kultivační nádoby), inokuluje se do kultivačních nádob ve vhodné hustotě a inkubuje při 37 °C.
Krátkodobé kultury potkaních hepatocytů se připravují tak, že se umožní čerstvě isolovaným hepatocytům přichytit se ve vhodném médiu k povrchu kultivační nádoby.
Kultury lidských lymfocytů jsou založeny pomocí vhodné metody.
1.2.3.2 Expozice kultur testované látce
Primární hepatocyty potkana. Čerstvě isolované hepatocyty potkana jsou exponovány testované látce v médiu obsahujícím
3
H-TdR
po vhodnou dobu. Po ukončené expozici je médium odstraněno, buňky promyty, fixovány a sušeny. Sklíčka jsou ponořena do autoradiografické emulse (alternativně může být použit stripping film), exponována, vyvolána, obarvena a vyhodnocena.
Stabilizované buněčné linie a lymfocyty
Autoradiografické techniky: Buněčné kultury jsou exponovány testované látce po vhodnou dobu a pak jsou vystaveny působení
3
H-TdR.
Doba působení je závislá na druhu testované látky, aktivitě metabolického systému a na typu buněk. K zachycení nejvyššího vrcholu UDS je třeba
3
H-TdR
přidat současně s testovanou látkou, nebo několik minut po expozici. Výběr mezi těmito postupy je ovlivněn možnou interakcí mezi testovanou látkou a
3
H-TdR.
K odlišení mezi UDS a semikonzervativní replikací DNA se užívá arginin deficientní médium, nízký obsah séra, nebo aplikace hydroxyurey do kultivačního média což způsobí inhibici semikonzervativní replikace DNA.
Stanovení UDS pomocí LSC: Před expozicí testované látce je třeba blokovat vstup buněk do S-fáze, jak bylo shora uvedeno. Buňky jsou pak exponovány testované látce jak bylo popsáno pro autoradiografii. Na konci kultivace je DNA extrahována z buněk a stanoven celkový obsah DNA a určen rozsah inkorporace
3
H-TdR
Jestliže jsou použity ve shora uvedených metodách lidské lymfocyty, je v nestimulovaných kulturách suprese semikonzervativní replikace DNA zbytečná.