1.2.3 Popis postupu
1.2.3.1 Pozorování
Pečlivé klinické sledování by mělo být prováděno nejméně jednou denně. Měla by být prováděna i dodatečná pozorování s odpovídajícími zákroky k minimalizaci ztrát. Zvířata je třeba pečlivě sledovat, aby se spolehlivě zachytil začátek a progrese všech toxických účinků, a také za účelem minimalizace ztrát v důsledku nemocí, autolýzy nebo kanibalismu.
Registrují se klinické příznaky včetně neurologických a očních změn u všech zvířat, a dále případy uhynutí. Zaznamenává se doba objevení a postup toxických příznaků včetně podezření na tumor.
Hmotnost se zaznamenává individuálně u všech zvířat jednou týdně během prvních 13 týdnů období testu a aspoň jednou za 4 týdny po tomto období. Je třeba provádět měření spotřeby potravy (a vody tam, kde je testovaná látka podávána v pitné vodě) týdně během prvních 13 týdnů a pak přibližně ve tříměsíčních intervalech, ledaže by zdravotní stav nebo změny tělesné hmotnosti ukázaly nutnost jiné frekvence sledování.
1.2.3.2 Hematologická vyšetření
Hematologická vyšetření (např. obsah hemoglobinu, hematokrit, celkový počet erytrocytů, celkový počet bílých krvinek, krevních destiček, nebo jiné ukazatele srážlivosti) by měla být prováděna za 3 měsíce, 6 měsíců a poté v přibližně šestiměsíčních intervalech, a na konci ve vzorcích krve shromážděných od všech nehlodavců, respektive od 10 potkanů, na pohlaví z každé skupiny. Tam, kde je to možné, by měly být vzorky ve všech intervalech od stejných potkanů. Navíc je potřeba odebrat vzorek před testem od všech nehlodavců.
Pokud klinické vyšetření zvířat naznačí zhoršený zdravotní stav zvířat během studie, měl by být stanoven diferenciální obraz bílých krvinek.
Diferenciální obraz bílých krvinek se vyšetří ve vzorcích od zvířat ve skupině s nejvyšší dávkou a u kontrol. Pokud tato data, nebo údaje z vyšetření patologických změn naznačí nutnost, vyšetří se i u skupiny s dávkou nejblíže nižší.
1.2.3.3 Analýza moči
Vzorky moči 10 potkanů každého pohlaví se sbírají pro analýzu pokud možno od stejných zvířat a ve stejných intervalech jako hematologické zkoušky. Následující stanovení jsou provedena buď na vzorcích jednotlivých zvířat nebo na směsném vzorku pro skupiny podle dávek a pohlaví:
- vzhled moči, objem a hustota u jednotlivých zvířat,
- proteiny, glukosa, ketolátky, okultní krvácení (semikvantitativně),
- mikroskopické vyšetření sedimentu (semikvantitativně).
1.2.3.4 Biochemické vyšetření
V přibližně šestiměsíčních intervalech a na závěr jsou odebrány krevní vzorky pro biochemická měření od všech nehlodavců a 10 potkanů obojího pohlaví v každé skupině, pokud možno od týchž potkanů ve všech intervalech. Od nehlodavců se vedle toho odeberou vzorky před testem. Z těchto vzorků je připravena plasma a jsou provedeny následující zkoušky:
- celková koncentrace proteinů,
- koncentrace albuminu,
- testy na funkci jater (např. aktivita bazické fosfatázy, aktivita glutamát pyruvát transaminázy (nyní známá jako sérová alanin aminotransferáza), glutamát acetát transaminázy (nyní známá jako sérová aspartát aminotransferáza), gama glutamyl transpeptidázy, ornitin dekarboxylázy,
- metabolismus glycidů, např. krevní glukosa nalačno,
- testy na funkci ledvin, např. dusík močoviny v krvi.
1.2.3.5 Pitva
Kompletní pitva se provede u všech zvířat, včetně těch, která zemřela během pokusu nebo byla utracena v agónii stavu. Před utracením se odeberou vzorky krve všech zvířat pro diferenciální obraz bílých krvinek. Všechny viditelné tumory nebo léze, které by mohly být tumory, je třeba uchovat. Provádí se porovnání anatomickopatologických změn s mikroskopickými nálezy.
Orgány a tkáně se uchovávají pro histopatologické vyšetření. Obvykle se jedná o následující orgány a tkáně: mozek (prodloužené míchy/mostu, mozečkové kory, kory mozkové), podvěsek mozkový, štítnou žlázu a příštítná tělíska, thymus, trachea a plíce, srdce, aortu, slinnou žlázu, játra, slezinu, ledviny, nadledviny, jícen, žaludek, dvanácterník, jejunum, ileum, slepé střevo, tračník, konečník, močový měchýř, lymfatické uzliny, slinivku, gonády, akcesorní pohlavních orgány, samičí mléčné žlázy, kůži, svalovinu, periferní nervy, míchu (krční, hrudní a bederní), sternum s kostní dření, stehenní kost včetně kloubů, a oči. Naplnění plic a močového měchýře fixativem je optimální cestou ke konzervaci těchto tkání; naplnění plic v inhalačních studiích, je zásadní pro odpovídající histopatologické zkoumání. Ve speciálních studiích jako jsou inhalační studie, má být studován celý respirační trakt včetně nosu, hltanu a hrtanu.
Poznámka: štítná žláza s příštitnými tělísky ze všech nehlodavců musí být zvážena stejně jako mozek, játra, ledviny, nadledviny a gonády z 10 zvířat na pohlaví a na skupinu u hlodavců a ze všech nehlodavců.
Byla-li provedena jiná klinická vyšetření, informace získané z těchto procedur by měly být k dispozici před mikroskopickým vyšetřením, protože mohou dát patologovi významné vodítko.
1.2.3.6 Histopatologie
Všechny viditelné změny, zvláště tumory a jiné léze vyskytující se v kterémkoli orgánu, se zkoumají mikroskopicky. Navíc jsou doporučeny následující postupy:
(a) mikroskopické vyšetření všech uchovaných orgánů a tkání s kompletním popisem všech lézí nalezených:
1. u všech zvířat, která uhynula nebo byla utracena během studie,
2. u všech zvířat ze skupiny s vysokou dávkou a kontrolní skupiny
(b) orgány či tkáně ukazující abnormity způsobené nebo pravděpodobně způsobené testovanou látkou jsou zkoumány také ve skupinách s nižšími dávkami,
(c) tam, kde výsledky svědčí pro významné zkrácení normální délky života zvířat nebo vyvolání účinků, které by mohly ovlivnit toxickou odpověď, skupina s nejblíže nižší dávkou se vyšetří popsaným způsobem,
(d) informace o incidenci lézí, které se normálně vyskytují v použitém kmeni zvířat, ve stejných laboratorních podmínkách, tj. historické kontrolní údaje, jsou nezbytné pro správné posouzení významnosti změn pozorovaných u zvířat s aplikovanou látkou.
------------------------------------------------------------------
10) Vyhláška č. 207/2004 Sb., o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat.