1.2.3 Popis postupu

1.2.3 Popis postupu

1.2.3.1 Příprava kultur

Stabilizovaná buněčná linie se připravuje se zásobní kultury (trypsinací, nebo setřepáním buněk z povrchu kultivační nádoby), inokuluje se do kultivačních nádob ve vhodné hustotě a inkubuje při 37 °C. Pro monovrstevné kultury se stanoví takový počet buněk v kultivační nádobě, aby na konci kultivace nevytvářely více než z 50 % konfluentní vrstvu. Lze také použít suspenzních kultur. Lidské lymfocytární kultury se připraví z heparinizované krve běžnými postupy a inkubují při 37 °C.

1.2.3.2 Expozice kultur

Buňky jsou exponovány testované látce v exponenciální fázi růstu po vhodnou dobu. Ve většině případů stačí jedna až dvě hodiny, ale expozice může být prodloužena až na dva buněčné cykly, je-li to třeba. Buňky, které nemají dostatečnou vlastní metabolickou aktivitu, musí být exponovány testovanou látkou v přítomnosti i nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Na konci expozice je testovaná látka z média odstraněna, buňky vymyty a dále kultivovány v růstovém médiu s BrdU dva replikační cykly. Alternativně mohou být buňky exponovány současně s testovanou látkou a BrdU po dobu dvou buněčných cyklů.

Lidské lymfocytární kultury jsou exponovány testovanou látkou dokud jsou v semisynchronizovaných podmínkách.

Buňky jsou analyzovány v druhém mitotickém dělení po expozici testované látce, která proběhla v nejcitlivějším stádiu buněčného cyklu. Všechny kultury s BrdU je třeba udržovat v temnu, nebo ve světle zastíněné žárovky, aby se zabránilo fotolýze DNA ve které je inkorporovaný BrdU.

1.2.3.3 Zpracování buněk

Jednu až čtyři hodiny před ukončením kultivace se do kultur přidá inhibitor dělícího vřeténka (např. kolchicin). Každá kultura se zpracovává samostatně.

1.2.3.4 Příprava preparátů a barvení

Preparáty se připraví standardní cytogenetickou technikou. Barvení preparátů ke znázornění SCE může být provedeno několika technikami (např. fluorescenční plus Giemsa).

1.2.3.5 Analýza

Počet analyzovaných buněk je závislý na spontánní frekvenci SCE v kontrole. Obvykle se hodnotí nejméně 25 dobře rozprostřených metafází na každou kulturu. Preparáty musí být zakódovány před analýzou. V lidských lymfocytech se analyzují pouze metafáze s 46 centromerami. U stabilizovaných linií pouze metafáze, které se liší o ± 2 centromery od modálního počtu centromer. Je třeba stanovit, zda se budou analyzovat SCE v oblasti centromery. Výsledky musí být ověřeny v nezávislých experimentech.