1.2.2 Popis postupu
1.2.2.1 Expozice a oplodnění
Používají se dva způsoby expozice. Nejčastěji se používá jedna aplikace testované látky. Také je možná varianta podávání testované látky sedm dní v týdnu po 35 dnů.
Počet oplodnění po expozici je řízen schématem experimentu a musí zajistit, že všechna buněčná stádia zárodečných buněk budou analyzována. Na konci období oplodňování jsou samice samostatně rozděleny do klecí. Po porodu je třeba zaznamenat datum, velikost vrhu a pohlaví mláďat. Po vrhu jsou samčí i samičí potomci odděleni až do doby zařazení do experimentu.
1.2.2.2 Zjišťování translokačních heterozygotů
Používá se jedna ze dvou možných metod. Test fertility
F
1
potomků a následná verifikace možných nositelů translokací cytogenetickou analýzou nebo cytogenetická analýza všech samců
F
1
generace bez předchozího výběru pomocí testu fertility.
(a) Test fertility
Snížená fertilita zvířat v
F
1
generaci se může stanovit z velikosti vrhu a/nebo analýzou obsahu dělohy samic. Kritéria určení normální a snížené fertility musí být stanovena pro každý kmen použitých myší.
Velikost vrhu:
F
1
samci určení k testování jsou odděleni samostatně do klecí se samicemi ze stejného experimentu, nebo stejné skupiny. Klece jsou kontrolovány denně počínaje 18. dnem po oplodnění. Velikost vrhu a pohlaví
F
2
potomků jsou zaznamenány při porodu, hned poté jsou odděleni. Jestliže jsou testovány
F samice, F
1 2
potomci malých vrhů jsou uchováváni pro další testy. Samice - nositelky translokací jsou verifikovány cytogenetickou analýzou translokací u jakéhokoliv jejich mužského potomka. X0 - samice jsou určeny změnou sex ratio mezi jejich potomky z 1 : 1 na 1 : 2 samci vs. samice. V následném kroku jsou normální
F
1
zvířata vyřazena z dalšího testování jestliže první
F
2
vrh dosahuje, nebo převyšuje předem určenou normální hodnotu, jinak jsou zaznamenány druhé a třetí vrhy.
F
1
zvířata která nemohou být klasifikována jako normální po vyhodnocení tří
F
2
vrhů, jsou dále testována buď analýzou obsahu dělohy, nebo jsou přímo podrobena cytogenetické analýze.
Analýzy obsahu dělohy: Redukce velikosti vrhu u nosičů translokací je způsobena smrtí embryí, takže vysoký počet mrtvých implantací indikuje přítomnost translokací u testovaných zvířat. Testovaní
F
1
samci jsou připouštěni každý ke 2 - 3 samicím. Oplodnění se zjišťuje denní ranní kontrolou vaginální zátky. Samice jsou usmrceny 14. - 16. den a jsou zaznamenány živé a mrtvé zárodky.
(b) Cytogenetická analýza
Metodou air-drying jsou připraveny preparáty z testes. Nosiči translokací jsou určeni na základě přítomnosti multivalentních figur ve stádiu diakinézy - metafáze I v primárních spermatocytech. Nález nejméně dvou buněk s multivalentními asociacemi splňuje požadovaný důkaz, že testované zvíře je nositelem translokace. Jestliže byl proveden výběr no breeding, všichni
F
1
samci jsou vyšetřeni cytogeneticky. Na každého samce musí být mikroskopicky vyšetřeno nejméně 25 buněk v diakinéze - metafáze I. Analýza mitotických metafází ve spermatogoniích nebo v kostní dřeni se vyžaduje u samců s malými testes a potlačením meiozy před diakinézou, nebo u
F
1
samic suspektních X0. Přítomnost neobvykle dlouhého a/nebo krátkého chromozómu v každé z 10 buněk je důkazem pro částečnou samčí translokační sterilitu (c-t typ). Některé X-autosomální translokace způsobující samčí sterilitu mohou být identifikovány pouze pruhováním mitotických chromozómů. Přítomnost 39 chromozómů ve všech 10 mitózách je důkazem pro X0 samice.
------------------------------------------------------------------
10) Vyhláška č. 207/2004 Sb., o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat.