443/2004 Sb. Vyhláška, kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků - 1.2.2 Experimentální podmínky

1.2.2 Experimentální podmínky

1.2.2.1 Testovací kmeny

Nejužívanější jsou diploidní kmeny

D , D , D a JD .

4 5 7 1

Užití jiných kmenů může být rovněž vhodné.

1.2.2.2 Média

Odpovídající kultivační média jsou užívána pro určení přežívajících buněk a frekvenci mitotické rekombinace.

1.2.2.3 Negativní a positivní kontroly

Positivní, neovlivněné a rozpouštědlem ovlivněné kontroly jsou používány současně. Pro každou specifickou mutační změnu mají být použity odpovídající positivní kontrolní chemické látky.

1.2.2.4 Koncentrace

Má být použito nejméně 5 vhodně zvolených koncentrací. Musí být brán ohled na cytotoxicitu a rozpustnost. Nejnižší koncentrace nesmí mít vliv na životnost buněk. U toxických látek nemá nejvyšší použitá koncentrace redukovat přežití pod 5 - 10 %. Látky ve vodě relativně nerozpustné mají být testovány až po mez rozpustnosti látky za použití vhodných postupů. Nejvyšší koncentrace pro látky netoxické, ve vodě rozpustné, je určena případ od případu.

Buňky mohou být vystaveny působení testované látky buď ve stacionární fázi, nebo během růstu po dobu až 18 h. Kultury dlouhodobě ovlivňované mají být mikroskopicky kontrolovány pro tvorbu spor, jejichž přítomnost test znehodnocuje.

1.2.2.5 Podmínky inkubace

Misky jsou inkubovány ve tmě po čtyři až sedm dní při 28 - 30 °C. Misky použité pro průkaz červených a růžových sektorů tvořených mitotickým překřížením mají být umístěny v chladničce (cca 4 °C) po další 1 - 2 dny před počítáním, aby se mohly utvořit odpovídající pigmentované kolonie.

1.2.2.6 Spontánní frekvence mitotické rekombinace

Používají se subkultury s frekvencí spontánních mutací v rozmezí akceptovaných normálních hodnot.

1.2.2.7 Počet replikací

Je nutno použít nejméně tří misek na jednu koncentraci u testu prototrofních buněk tvořených mitotickou genovou konversí a pro určení životnosti buněk. V případě testování recesivní homozygosity tvořené mitotickým překřížením má být počet misek zvýšen, aby bylo dosaženo dostatečného počtu kolonií.

1.2.2.8 Postup

Ovlivnění S. cerevisiae probíhá obvykle jako zkumavkový test v tekutém prostředí a zahrnuje buď stacionární nebo rostoucí buňky. Základní pokusy mají být provedeny na rostoucích buňkách.

1-5 x 10

buněk/ml je vystaveno testované látce po dobu až 18 h při 28 až 37 °C za třepání. Odpovídající množství metabolického aktivačního systému je přidáno v průběhu ovlivnění, pokud je to potřebné.

Po skončení ovlivnění jsou buňky centrifugovány, promyty a vyočkovány na vhodné kultivační medium. Po inkubaci jsou počítány přežívající buňky a buňky s indukcí mitotické rekombinace.

Jestliže je první pokus negativní, má být proveden druhý pokus s buňkami ve stacionární fázi. Jestliže je první pokus positivní, je potvrzen dalším vhodným nezávislým experimentem.