Princip
Doporučuje se použít IF test jako hlavní screeningový test, protože byla prokázána jeho schopnost dosáhnout požadovaných prahů.
Použije-li se jako hlavní screeningový test a jeho výsledek je pozitivní, musí být jako druhý screeningový test proveden test PCR nebo FISH. Jestliže se test IF použije jako druhý screeningový test a jeho výsledek je pozitivní, je pro dokončení analýzy nutné další testování podle postupového diagramu.
Poznámka:
Pokud je IF test používán jako hlavní vyšetřovací test, používá se vždy polyklonální protilátka. V případě pozitivního výsledku IF testu s polyklonální protilátkou může být další vyšetření vzorku s monoklonální protilátkou přesnější, ale méně citlivé.
Používají se protilátky proti známému kmenu původce kroužkovitosti - ATCC33113 (NCPPB 2137) nebo NCPPB 2140. Doporučuje se určovat titr pro každou novou řadu protilátek. Titr je stanoven jako nejvyšší ředění, při kterém dochází k optimální reakci při testování suspenze obsahující 105 až 106 buněk na 1 ml homologického kmene původce kroužkovitosti a při použití vhodného konjugátu fluorescenčního isothiokyanatanu (FITC) podle doporučení výrobce. Nezpracované polyklonální nebo monoklonální protilátky by měly mít IF titr alespoň 1:2 000. Během testu by se měly protilátky používat v pracovním ředění (WD) v blízkosti titru nebo na titru. Používají se validované protilátky (viz internetovou stránku http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Test se provádí na čerstvě připravených vzorkových extraktech. V případě potřeby může být úspěšně proveden na extraktech skladovaných při -68 až -86 °C v glycerolu. Glycerol lze ze vzorku odstranit přidáním 1 ml peletového pufru (dodatek 4), opětovným odstředěním po dobu 15 minut při 7 000 g a resuspenzí ve stejném množství peletového pufru. To často není nutné, zejména pokud jsou sklíčka se vzorky fixována plamenem (viz 4.2).
Připraví se oddělená pozitivní kontrolní sklíčka s homologickým kmenem nebo s jiným srovnávacím kmenem původce kroužkovitosti, suspendovaným ve výluhu z brambor podle dodatku 2 a nepovinně v pufru.
Pletivo infikované přirozenou cestou (uchovávané lyofilizací nebo zmrazením při teplotě -16 až -24 °C) by se mělo podle možnosti použít jako paralelní kontrola na stejném podložním sklíčku.
Jako negativní kontroly se použijí alikvotní části vzorkových extraktů, které byly předtím testovány s negativním výsledkem.
Použijí se mikroskopická sklíčka s více okénky, nejlépe s 10 okénky o průměru nejméně 6 mm.
Test kontrolního materiálu se provede stejným způsobem jako test vzorků.
4.1. Sklíčka na test se připraví jedním z následujících postupů:
a) Pro pelety s relativně nízkým množstvím škrobového sedimentu:
Napipetuje se měřené standardní množství (pro okénka o průměru 6 mm je vhodné 15 μl - pro větší okénka objem vyšší) roztoku resuspendované bramborové pelety 1/100 do prvního okénka. Následně se napipetuje stejné množství nezředěné pelety (1/1) do zbývajících okének v řadě. Druhou řadu lze použít jako duplikát nebo pro druhý vzorek podle obrázku 1.
b) Pro jiné pelety:
Připraví se desetinná ředění (1/10 a 1/100) resuspendované pelety v peletovém pufru. Napipetuje se měřené standardní množství (pro okénka o průměru 6 mm je vhodné 15 μl - pro větší okénka objem vyšší) resuspendované pelety 1/100 a každého roztoku do řady okének. Druhou řadu lze použít jako duplikát nebo pro druhý vzorek podle obrázku 2.
4.2. Vysuší se kapky při pokojové teplotě nebo zahřátím na teplotu 40 až 45 °C. Bakteriální buňky se fixují na sklíčko buď zahřátím (15 minut při teplotě 60 °C), nad plamenem nebo pomocí 95% etanolu nebo podle zvláštních pokynů dodavatelů protilátek.
V případě potřeby lze potom fixovaná sklíčka před dalším použitím skladovat zmrazená v suchém boxu po co možná nejkratší dobu (maximálně 3 měsíce).
4.3. Postup IF testu:
a) Podle přípravy sklíčka na test v oddílu 4.1 písm. a):
Připraví se sada dvojnásobných roztoků protilátky v IF pufru. V první jamce by měl být titr 1/2 (T/2), v ostatních titr 1/4 (T/4), titr 1/2 (T/2), titr (T) a dvojnásobný titr (2T).
b) Podle přípravy sklíčka na test v oddílu 4.1 písm. b):
Připraví se pracovní ředění (WD) protilátky v IF pufru. Pracovní ředění ovlivňuje přesnost.
Obrázek 1: Příprava sklíčka na test podle oddílu 4.1. písm. a) a oddílu 4.3. písm. a)
Obrázek 1
Obrázek 2: Příprava sklíčka na test podle oddílu 4.1. písm. b) a oddílu 4.3 b)
Obrázek 2
4.3.1. Podložní sklíčka se uspořádají na navlhčený papír. Každé testovací okénko se pokryje kompletně ředěním protilátek. Množství protilátky na každém okénku musí být nejméně stejné jako množství použitého extraktu.
Pokud nejsou k dispozici konkrétní pokyny od dodavatele protilátek, postupuje se následovně:
4.3.2. Podložní sklíčka se inkubují na vlhkém papíře přikrytá po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18 - 25 °C).
4.3.3. Setřesou se kapky ze všech podložních sklíček a tato se pečlivě opláchnou pufrem IF. Umyjí se ponořením po dobu 5 minut v pufru IF Tween (dodatek 3) a následně v pufru IF. Je třeba zabránit vzniku aerosolu nebo přenosu kapiček, které by mohly způsobit vzájemnou kontaminaci, a pečlivě odstranit přebytečnou vlhkost jemným osušením.
4.3.4. Sklíčka se umístí na vlhký papír. Testovací okénka se pokryjí ředěním konjugátu FITC, kterým se stanovuje titr. Množství konjugátu naneseného do okének musí být stejné jako množství použité protilátky.
4.3.5. Zakrytá sklíčka se inkubují na vlhkém papíru po dobu 30 minut při pokojové teplotě (18 - 25 °C).
4.3.6. Kapky konjugátu se setřesou ze sklíček a tato se opláchnou a umyjí jako předtím (4.3.3.).
Opatrně se odstraní přebytečná vlhkost.
4.3.7. Napipetuje se 5 - 10 μl 0,1 M fosfátového pufru s glycerolem (dodatek 3) nebo komerční krycí tekutiny do každého okénka a přiloží krycí sklíčko.
4.4. Vyhodnocení IF testu
4.4.1. Testovací sklíčka se prohlížejí epifluorescenčním mikroskopem s filtry vhodnými pro excitaci FITC pod olejovou nebo vodní imersí při zvětšení 500x až 1 000x. Zkoumají se okénka ve dvou navzájem kolmých průměrech a kolem obvodu. U vzorků s žádnými nebo malým počtem buněk se zkoumá nejméně 40 polí mikroskopu.
Nejdřív se zkontroluje pozitivní kontrolní vzorek. Buňky musí být jasně fluoreskující a zcela obarvené v určeném titru protilátky nebo pracovním ředění. Pokud je barevnost odchylná, musí být test IF opakován (oddíl 4).
4.4.2. Pozorují se jasně fluoreskující buňky s charakteristickou morfologií Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus v testovacích okénkách sklíčka (viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intenzita fluorescence musí být při porovnání s pozitivním kontrolním kmenem ve stejném ředění protilátky stejná nebo lepší. Buňky s neúplným zbarvením nebo slabou fluorescencí nelze brát v úvahu.
Při podezření z jakékoli kontaminace musí být test zopakován. To se může stát, když všechna sklíčka ve skupině vykazují pozitivní buňky díky kontaminaci pufru nebo při zjištění pozitivních buněk (mimo okénka sklíček) na povrchu sklíček.
4.4.3. Existuje několik problémů podstatných pro přesnost imunofluorescenčního testu. V peletách z pupkové části bramboru a částí stonku se mohou vyskytnout doprovodné populace fluoreskujících buněk s atypickou morfologií a křížově reagující saprofytické bakterie s velikostí a morfologií podobnou Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
4.4.4. Berou se v úvahu pouze fluoreskující buňky s typickou velikostí a morfologií v titru nebo pracovním ředění protilátek podle oddílu 4.3.
4.4.5. Interpretace výsledku IF testu:
a) Při zjištění jasně fluoreskujících buněk s typickou morfologií se odhadne průměrný počet typických buněk v 1 mikroskopickém poli a vypočítá počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety (dodatek 4).
Výsledek IF je pozitivní u vzorků, kde je počet typických buněk na 1 ml resuspendované pelety nejméně
3
5 x 10 .
Vzorek je považován na potenciálně infikovaný a je povinné další testování.
b) Výsledek IF testu je negativní pro vzorky, které obsahují méně než
3
5 x 10
buněk na 1 ml resuspendované pelety a vzorek se považuje za negativní. Další testování není nutné.