Dodatek 7
Validovaná činidla pro FISH test
1. Oligosondy
Sonda specifická pro
R. solanacearum OLI-1-CY3: 5'-ggc agg tag caa gct acc ccc-3'
Nespecifická eubakteriální
sonda EUB-338-FITC: 5'-gct gcc tcc cgt agg agt-3'
2. Fixační roztok
(Upozornění: Fixační roztok obsahuje paraformaldehyd, který je toxický. Použít rukavice a nevdechnout. Doporučuje se pracovat v digestoři.)
i) Zahřeje se 9 ml molekulárně čisté vody [např. Ultra pure water = (UPW)] na teplotu přibližně 60 °C a přidá se 0,4 g paraformaldehydu. Paraformaldehyd se rozpustí po přidání 5 kapek 1N NaOH a zamíchání magnetickým míchadlem.
ii) Upraví se pH na 7,0 přidáním 1 ml fosfátového pufru 0,1 M (PB; pH 7,0) a 5 kapek HCl 1N. Zkontroluje se pH indikačním proužkem a v případě potřeby se upraví pomocí HCl nebo NaOH. (Upozornění: V roztocích s paraformaledhydem nepoužívat měřič Ph!)
iii) Přefiltruje se roztok přes membránový filtr 0,22 μm a skladuje se chráněný před prachem při teplotě 4 °C do dalšího použití.
3. 3x Hybmix
NaCl 2,7 M
Tris-HCl 60 mM (pH 7,4)
EDTA (sterilizovaný přes
filtr a autoklávovaný) 15 mM
Zředí se až 1x, podle potřeby.
4. Hybridizační roztok
1x Hybmix
Sodium dodecyl sulfát (SDS) 0,01 %
Formamid 30 %
Sonda EUB 338 5 ng/μl
Sonda OLI-1 nebo OLI2 5 ng/μl
Připraví se množství hybridizačního roztoku podle výpočtů v tabulce 1. Pro každé sklíčko (obsahující dvojmo 2 různé vzorky) je třeba 90 μl hybridizačního roztoku. Upozornění: Formamid je velmi jedovatý, nutno používat rukavice a učinit potřebná bezpečnostní opatření!
Tabulka 1. Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi
+-----------------------------------+-------+-------+-------+-------+-------+
| Počet sklíček | 1 | 4 | 6 | 8 | 10 |
+-----------------------------------+-------+-------+-------+-------+-------+
| Sterilní ultra čistá voda | 23,1 | 92,4 | 138,6 | 184,8 | 231,0 |
+-----------------------------------+-------+-------+-------+-------+-------+
| 3 x Hybmix | 30,0 | 120,0 | 180,0 | 240,0 | 300,0 |
+-----------------------------------+-------+-------+-------+-------+-------+
| 1 % SDS | 0,9 | 3,6 | 5,4 | 7,2 | 9,0 |
+-----------------------------------+-------+-------+-------+-------+-------+
| Formamid | 27,0 | 108,0 | 162,0 | 216,0 | 270,0 |
+-----------------------------------+-------+-------+-------+-------+-------+
| Sonda EUB 338 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
+-----------------------------------+-------+-------+-------+-------+-------+
| Sonda OLI-1 nebo OLI2 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
+-----------------------------------+-------+-------+-------+-------+-------+
| Celkové množství | 90,0 | 360,0 | 540,0 | 720,0 | 900,0 |
+-----------------------------------+-------+-------+-------+-------+-------+
Poznámka:
Všechny roztoky obsahující světlocitlivé oligosondy se uchovávají v temnu při teplotě -20 °C. Během použití se chrání před přímým slunečním zářením nebo elektrickým světlem.
5. 0,1M fosfátový pufr, pH 7,0
Na HPO 8,52 g
2 4
KH PO 5,44 g
2 4
Destilovaná voda 1,00 l
Rozpustí se složky, zkontroluje pH a sterilizuje autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.