Dodatek 7
Validovaná činidla pro FISH test
1. Oligosondy
Sonda specifická pro
Cms CMS-CY3-01: 5'-ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg-3'
Nespecifická eubakteriální
sonda EUB-338-FITC: 5'-gct gcc tcc cgt agg agt-3'
2. Fixační roztok
(Upozornění: Fixační roztok obsahuje paraformaldehyd, který je toxický! Používat rukavice a nevdechovat. Doporučuje se pracovat v digestoři.)
i) Zahřeje se 9 ml molekulárně čisté vody [např. Ultra pure water = (UPW)] na teplotu přibližně 60 °C a přidá se 0,4 g paraformaldehydu. Paraformaldehyd se rozpustí po přidání 5 kapek 1N NaOH a zamíchání magnetickým míchadlem.
ii) Upraví se pH na 7,0 přidáním 1 ml fosfátového pufru 0,1 M (PB; pH 7,0) a 5 kapek HCl 1N. Indikačním proužkem se zkontroluje pH a v případě potřeby se upraví pomocí HCl nebo NaOH.
(Upozornění: V roztocích s paraformaledhydem nepoužívat měřič pH!)
iii) Roztok se přefiltrujte přes membránový filtr 0,22 μm a skladuje se chráněný před prachem při teplotě 4 °C do dalšího použití.
iv) Poznámka:
Alternativní fixační roztok: 96% etanol.
3. 3x Hybmix
NaCl 2,7 M
Tris-HCl 60 mM (pH 7,4)
EDTA (sterilizovaný přes
filtr a autoklávovaný) 15 mM
Zředí se až 1x, podle potřeby.
4. Hybridizační roztok
1x Hybmix
Sodium dodecyl sulfát (SDS) 0,01 %
Sonda EUB 338 5 ng/μl
Sonda CMSCY 301 5 ng/μl
Připraví se množství hybridizačního roztoku podle výpočtů v tabulce. Pro každé sklíčko (obsahující dvojmo 2 různé vzorky) je třeba 90 μl hybridizačního roztoku.
Tabulka: Doporučená množství pro přípravu hybridizační směsi
----------------------------+-----------+-----------
| 2 sklíčka | 8 sklíček
----------------------------+-----------+-----------
Sterilní ultra čistá voda | 50,1 | 200,4
3x hybmix | 30,0 | 120,0
1 % SDS | 0,9 | 3,6
sonda EUB 338 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0
sonda CMSCY 301 (100 ng/μl) | 4,5 | 18,0
----------------------------+-----------+-----------
Celkový objem (μl) | 90,0 | 360,0
----------------------------+-----------+-----------
Poznámka:
Všechny roztoky obsahující světlocitlivé oligosondy se uchovávají v temnu při teplotě -20 °C. Během použití je nutné je ochraňovat před přímým slunečním zářením nebo elektrickým světlem.
5. 0,1 M fosfátový pufr, pH 7,0
Na HPO 8,52 g
2 4
KH PO 5,44 g
2 4
Destilovaná voda 1,00 l
Složky se rozpustí, zkontroluje se pH a sterilizuje se autoklávováním při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.