Dodatek 5
Média pro izolaci a kultivaci C. m. subsp. sepedonicus
1. Obecná růstová média
Živný agar (Nutrient agar = NA)
Živný agar (Difco) 23 g
Destilovaná voda 1,00 l
Složky se rozpustí a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.
Živný dextrózový agar (Nutrient dextrose agar = NDA)
Difco bakto živný agar obsahující 1 % D(+) glukózy (monohydrátu). Provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 20 min.
Kvasnično-pepton-glukózový agar (Yeast peptone glucose agar = YPGA)
Kvasnicový extrakt (Difco) 5,0 g
Baktopepton (Difco) 5,0 g
D(+) glukóza (monohydrát) 10,0 g
Baktoagar (Difco) 15,0 g
Destilovaná voda 1,00 l
Složky se rozpustí a provede se sterilizace v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min.
Médium s kvasnicovým extraktem a minerálními solemi (Yeast extract mineral salts medium = YGM)
Kvasnicový extrakt (Difco) 2,0 g
D(+) glukóza (monohydrát) 2,5 g
K HPO 0,25 g
2 4
KH PO 0,25 g
2 4
MgSO . 7 H O 0,1 g
4 2
MnSO . H O 0,015 g
4 2
NaCl 0,05 g
FeSO . 7 H O 0,005 g
4 2
Baktoagar (Difco) 18,0 g
Destilovaná voda 1,00 l
Složky se rozpustí a provede se sterilizace 0,5 l média v autoklávu při 115 °C po dobu 20 min.
b) Validovaná selektivní růstová média
Médium MTNA
Pokud není uvedeno jinak, pocházejí všechny složky médií z BDH.
Kvasnicový extrakt (Difco) 2,0 g
Manit 2,5 g
K HPO 0,25 g
2 4
KH PO 0,25 g
2 4
MgSO . 7 H O 0,1 g
4 2
MnSO . H O 0,015 g
4 2
NaCl 0,05 g
FeSO . 7 H O 0,005 g
4 2
Agar (Oxoid č. 1) 16,0 g
Destilovaná voda 1,00 l
Složky se rozpustí, pH se upraví na 7,2. Po autoklávování (při 121 °C po dobu 15 min.) a ochlazení na 50 °C se přidají antibiotika: trimethoprim 0,06 g, nalidixic acid 0,002 g, amphotericin B 0,01 g.
V zásobě se nechají roztoky antibiotik: trimethoprim (Sigma) a nalidixic acid (Sigma) (obě 5 mg/ml) v 96% metanolu, amphotericin B (Sigma) (1 mg/ml) v dimethyl sulfoxidu. Zásobní roztoky jsou sterilizované filtrací.
Poznámka:
Trvanlivost základního média je 3 měsíce. Po přidání antibiotik je trvanlivost 1 měsíc při skladování v chladu do 8 +/- 2 °C.
Médium NCP-88
Živný agar (Difco) 23,0 g
Kvasnicový extrakt (Difco) 2,0 g
D-manit 5,0 g
K HPO 2,0 g
2 4
KH PO 0,5 g
2 4
MgSO . 7 H O 0,25 g
4 2
Destilovaná voda 1,00 l
Složky se rozpustí, upraví se pH na 7,2. Po autoklávování a ochlazení na 50 °C se přidají následující antibiotika: polymyxin B sulphate (Sigma) 0,003 g, nalidixic acid (Sigma) 0,008 g, cycloheximide (Sigma) 0,2 g.
Antibiotika se rozpustí pro přípravu zásobních roztoků následovně: nalidixic acid v 0,01 M NaOH, cykloheximid v 50% etanolu, polymyxin B sulphate v destilované vodě. Zásobní roztoky se sterilizují filtrací.
Poznámka:
Trvanlivost základního média je 3 měsíce. Po přidání antibiotik je trvanlivost 1 měsíc při skladování v chladu do 8 +/- 2 °C.