Dodatek 2
Příprava pozitivních a negativních kontrol pro vyšetření výkrojků testy PCR/IF a FISH
Vypěstuje se 72 hodinová kultura virulentního kmene C. m. subsp. sepedonicus (NCPPB 4053 nebo PD 406) na základním médiu MTNA a suspenduje se v 10 mM fosfátového pufru pro získání hustoty přibližně
8
1 až 2 x 10
buněk schopných tvorby kolonií/ml. Toho se obvykle dosáhne prostřednictvím slabě zakalené suspenze odpovídající optické hustotě 0,20 - 600 nm.
Výkrojky pletiva se odeberou z pupkových konců 200 hlíz odebraných z produkce odrůdy s bílou slupkou, u které je jisté, že je prosta C. m. subsp. sepedonicus.
Pupkové výkrojky se zpracují obvyklým způsobem a resuspenduje se peleta v 10 ml.
Připraví se 10 sterilních mikrozkumavek o objemu 1,5 ml s 900 μl resuspendované pelety.
Přenese se 100 μl suspenze C. m. subsp. sepedonicus do první mikrozkumavky. Nechá se protřepat.
V následujících pěti mikrozkumavkách se provedou desetinná ředění.
Šest kontaminovaných mikrozkumavek se použije jako pozitivní kontrola. Čtyři nekontaminované mikrozkumavky se použijí jako negativní kontroly. Mikrozkumavky se opatří štítkem.
Připraví se alikvotní části z 100 μl ve sterilních mikrozkumavkách o objemu 1,5 ml, čímž se získá 9 kopií každého kontrolního vzorku. Skladování probíhá při teplotě -16 až -24 °C až do doby použití.
Přítomnost a množství C. m. subsp. sepedonicus v kontrolních vzorcích by měla být nejprve potvrzena prostřednictvím imunofluorescence.
Pro PCR test se provede extrakce DNA z pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.
Pro IF a FISH testy se provedou kvantitativní rozbory pozitivních a negativních kontrolních vzorků pro každou sérii zkušebních vzorků.
Při kvantitativních rozborech IF, FISH a PCR musí být C. m. subsp. sepedonicus zjištěn v nejméně v
6 4
10 a 10
buněk/ml pozitivních kontrol a nesmí být zjištěn v žádné z negativních kontrol.