3.1. Hlízy bramboru
Poznámka:
- Standardní velikost vzorku je 200 hlíz na 1 test. Intenzivnější vzorkování vyžaduje více testů na vzorcích této velikosti. Větší množství hlíz ve vzorku vede k zpomalení nebo složitějšímu výkladu výsledků. Postup však lze vhodně použít i pro vzorky s méně než 200 hlízami, pokud je k dispozici menší množství hlíz.
- Validace všech níže uvedených zjišťovacích metod je založená na testování vzorků o velikosti 200 hlíz.
- Níže popsaný bramborový extrakt lze použít také pro zjištění původce hnědé hniloby, Ralstonia solanacearum.
Nepovinné ošetření před přípravou vzorku:
Hlízy se omyjí. Použijí se vhodné dezinfekční prostředky (s obsahem chlóru, jestliže má být proveden PCR test, pro odstranění možné patogenní DNA) a mycí prostředky mezi každým vzorkem. Hlízy se nechají oschnout na vzduchu. Tento postup mytí je obzvlášť užitečný v případě, že je ve vzorku příliš zeminy a jestliže se má provádět PCR test nebo přímá izolace.
3.1.1. Pomocí čistého a dezinfikovaného skalpelu nebo nožem či škrabkou na brambory se odstraní slupka na pupkovém konci každé hlízy. Opatrně se vyříznou konické výkrojky vodivého pletiva z pupkových konců brambor. Na minimum se omezí nadbytečná část pletiva nezahrnující cévní svazky. Po odebrání musí být výkrojky z pupkových konců zpracovány do 24 hodin nebo konzervovány při -20 °C po dobu nejdéle dvou týdnů.
Všechny hlízy s podezřelými příznaky bakteriální kroužkovitosti se dají stranou a testují se odděleně.
Pokud jsou při vyříznutí výkrojku z pupkového konce zjištěny příznaky kroužkovitosti, provede se vizuální vyšetření této hlízy po naříznutí hlízy na pupkovém konci. Všechny naříznuté hlízy s podezřelými příznaky se nechají korkovatět po dobu 2 dnů při pokojové teplotě a uchovávají se v karanténě při teplotě 4 - 10 °C až do ukončení všech testů. Všechny hlízy ve vzorku se uchovávají podle přílohy č. 2.
3.1.2. Výkrojky z pupkové části se shromáždí v nepoužitých nádobách na jedno použití, které jsou uzavíratelné a/nebo utěsnitelné (v případě, že jsou nádoby znovu používány, musí být důkladně vyčištěny a dezinfikovány prostředky s obsahem chlóru). Nejlépe je zpracovat výkrojky z pupkového konce okamžitě, pokud to není možné, uchovávají se v nádobě bez přidání pufru, v chladu po dobu maximálně 72 hodin nebo při pokojové teplotě maximálně 24 hodin. Schnutí a suberizace výkrojků a růst saprofytů v průběhu skladování může bránit zjištění přítomnosti bakterie způsobující kroužkovitost.
3.1.3. Výkrojky z pupkového konce se zpracují jedním z následujících postupů:
a) výkrojky se zalijí dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 3) a třepají se v rotační třepačce (50 - 100 ot/min) po dobu 4 hodin při teplotě nižší než 24 °C nebo po dobu 16 - 24 hodin chlazené;
nebo
b) výkrojky se homogenizují s dostatečným množstvím (přibližně 40 ml) extrakčního pufru (dodatek 3), buď v mixéru nebo rozdrcením v utěsněném jednorázovém maceračním sáčku za použití gumového tloučku nebo vhodného mlecího zařízení.
Poznámka:
Při homogenizaci vzorků za použití mixéru existuje vysoké nebezpečí křížové kontaminace vzorků. Je nutno učinit bezpečnostní opatření pro zamezení vzniku aerosolu nebo rozlití během extrakce. Pro každý vzorek musí být použita čerstvě sterilizovaná ostří (nože) a nádoby. Pokud má být použit PCR test, je nutno zamezit přenosu DNA na nádoby nebo mlecí zařízení, doporučuje se drcení v sáčcích na jedno použití a použití zkumavky na jedno použití.
3.1.4. Dekantuje se supernatant. Pokud je nadměrně zakalený, pročistí se buď pomalým odstředěním (při maximálně 180 g po dobu 10 minut při teplotě 4 - 10 °C) nebo vakuovou filtrací (40 - 100 μm), filtr se omyje přídavkem (10 ml) extrakčního pufru (dodatek 3).
3.1.5. Bakteriální frakce se zahustí odstřeďováním při 7 000 g po dobu 15 minut (nebo 10 000 g po dobu 10 minut) při teplotě 4 - 10 °C a odstraní se supernatant, aniž by se rozvířila peleta.
3.1.6. Resuspenduje se peleta v 1,5 ml peletového pufru (dodatek 3). Použije se 500 μl pro test na Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, 500 μl pro Ralstonia solanacearum a 500 μl pro referenční účely. Přidá se sterilní glycerol na konečnou koncentraci 10 - 25 % (v/v) k 500 μl referenční poměrné části a ke zbývající části vzorku, promíchá se vířením a uloží při teplotě -16 až -24 °C (týdny) nebo při teplotě -68 až -86 °C (měsíce). Extrakty se během testování uchovávají při teplotě 4 - 10 °C.
Opakované zmrazení a rozmrazení se nedoporučuje.
Pokud je nutný transport extraktu, zajistí se přeprava v chladícím boxu do 24 až 48 hodin.
3.1.7. Je nezbytně nutné, aby se se všemi pozitivními kontrolami a vzorky Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus zacházelo odděleně, aby se předešlo kontaminaci. To platí i pro sklíčka na IF testy a všechny testy.