1 Metoda
1.1 Úvod
Cílem zkoušky je určení vlivu látky na růst jednobuněčných zelených řas. Relativně krátkodobé pokusy (72 hodin) mohou být použity na zhodnocení účinků na několik generací řas. Tato metoda může být upravena pro použití na několika druzích řas, přičemž protokol o zkoušce musí obsahovat popis metodiky.
Metoda je vhodná zejména pro stabilní látky rozpustné za podmínek zkoušky ve vodě.
Metoda je použitelná pro látky, které přímo neinterferují s měřením růstu řas. Pokud je to možné, je žádoucí mít ještě před začátkem testu informace o rozpustnosti látky ve vodě, o tenzi par, o chemické stabilitě, o disociačních konstantách a o biologické rozložitelnosti odbouratelnosti látky.
Jak při plánování zkoušky, tak při interpretaci výsledků by měly být brány v úvahu další informace (např. strukturní vzorec, stupeň čistoty látky, podstata a procento znečištění látky, přítomnost a množství aditiv, rozdělovací koeficient n-oktanol/voda).
1.2 Definice a jednotky
Hustota buněk: počet buněk na 1 ml.
Růst: zvyšování hustoty buněk během doby trvání zkoušky.
Rychlost růstu: přírůstek hustoty buněk za jednotku času.
EC50: koncentrace zkoušené látky, která inhibuje růst buněk nebo snižuje růstovou rychlost o 50 % ve srovnání s kontrolou.
NOEC (no observed effect concentration): je nejvyšší zkoumaná koncentrace, při které nedochází k žádnému statisticky zjistitelnému snížení růstu nebo růstové rychlosti ve srovnání s kontrolou.
1.3 Referenční látky
Referenční látka může být použita jako prostředek na ověření faktu, že za laboratorních podmínek zkoušky se citlivost zkušebních organizmů významně nezměnila.
Použití referenční látky je nutné uvést do protokolu o zkoušce. Jako referenční látka může být použit dichroman draselný, ale jeho barva může ovlivnit kvalitu a intenzitu světla dostupného buňkám a také spektrofotometrická měření. Dichroman draselný byl použit v mezinárodních mezilaboratorních zkouškách (viz. (3) a příloha 2).
1.4 Princip metody
Za účelem prokázání, že EC50 je vyšší než 100 mg.1-1 je možné provést limitní zkoušku při této koncentraci.
Exponencielně rostoucí kultury vybraných zelených řas jsou vystaveny účinku různých koncentrací zkoušené látky za definovaných podmínek.
Zkoušené roztoky se inkubují 72 hodin, během nichž se měří hustota buněk v každém roztoku přinejmenším každých 24 hodin. Je stanovována inhibice růstu ve vztahu ke kontrolní kultuře.
1.5 Kritéria kvality
Kritéria kvality se vztahují na limitní zkoušku i na úplnou zkoušku.
Hustota buněk v kontrolních kulturách by se měla zvýšit přinejmenším šestnáctkrát za 3 dny.
Koncentrace zkoušených látek by se měla udržet v rozmezí 80 % původní koncentrace po celou dobu trvání zkoušky.
U látek, které se lehce rozpouštějí ve zkušebním médiu a dávají stabilní roztoky (netěkají, nerozkládají se, nehydrolyzují či adsorbují), se počáteční koncentrace může pokládat za ekvivalentní s nominální koncentrací. To, že se koncentrace udržela na určité úrovni po celou dobu zkoušky a že kritéria kvality byla dodržena, musí být dokladováno.
Pro látky, které jsou:
(i) slabě rozpustné ve zkušebním médiu, nebo
(ii) schopné vytvářet stabilní emulze nebo disperze, nebo
(iii) nestabilní vodné roztoky,
musí být počáteční koncentrace brána jako koncentrace naměřená na začátku zkoušky. Koncentrace musí být stanovována po jejím ustálení.
Ve všech případech se musí provádět další měření koncentrace během zkoušky za účelem stanovení aktuální expoziční koncentrace a kontroly dodržení kritérií kvality.
Je známo, že podstatná část zkoušené látky se může během zkoušky zabudovat do biomasy řas. Proto by se za účelem prokázání dodržení kritérií kvality mělo brát v úvahu jak množství látky inkorporované do biomasy řas, tak látka v roztoku (nebo, když to není technicky možné změřit, ve vodním sloupci). Protože však stanovení koncentrace látky v biomase řas může představovat technické obtíže, dodržení kritérií kvality může být prokázáno změřením nejvyšší koncentrace látky ve zkušební nádobě bez řas a stanovením koncentrace v roztoku (nebo, jestliže to není technicky možné, ve vodním sloupci) na začátku a na konci zkoušky.
1.6 Popis zkušební metody
1.6.1 Reagencie
1.6.1.1 Roztoky zkoušených látek
Základní roztoky požadované síly jsou připravovány rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo vodě podle odstavce 1.6.1.2.
Zvolené koncentrace jsou připravovány přidáním odpovídajícího množství látky k předkulturám řas (viz příloha 1).
Látky by měly být zkoušeny až do hranice jejich rozpustnosti. Abychom si zajistili, že bude dosažena maximální rozpustná/stabilní koncentrace, je možné u některých látek (např. s nízkou rozpustností ve vodě, nebo vysokým Pow, nebo spíše tvořících stabilní disperze než pravé roztoky ve vodě) provést zkoušku při koncentraci vyšší než je hranice rozpustnosti. Je ovšem nutné, aby tato koncentrace jinak nenarušovala systém (např. vytvořením filmu na hladině bránícím okysličení vody, atd).
Pro přípravu základních roztoků látek s nízkou rozpustností ve vodě se mohou použít ultrazvuková dispergace, organická rozpouštědla či emulgační látky. Když jsou použity pomocné látky měly by všechny zkoušené vzorky a koncentrace, včetně kontrol obsahovat těchto látek stejné množství. Koncentrace pomocných látek by měla být minimální a v žádném případě by neměla přesáhnout 100 mg.1-1 zkoušeného média.
Zkouška by se měla provádět bez korekcí pH. Dochází-li k výrazné změně pH, doporučuje se provést znovu zkoušku s korekcí pH a výsledky zaznamenat. V těchto případech by měla být hodnota pH základního roztoku přizpůsobena pH rozpouštědla (vody), pokud neexistují specifické důvody tak neučinit. Přednost se dává použití HCl a NaOH. Přizpůsobení pH nesmí významně ovlivnit koncentraci zkoušené látky v základním roztoku. Vznik chemické reakce nebo fyzikální precipitace ve zkušebním médiu jako následek přizpůsobení pH se musí zaznamenat.
1.6.1.2 Zkušební médium
Voda by měla být kvalitní destilovaná nebo deionizovaná s vodivostí menší než 5 μS.cm-1
Destilační aparát nesmí obsahovat měděné části.
Doporučováno je následující médium:
Připraví se čtyři zásobní roztoky dle následující tabulky. Tyto roztoky se sterilizují membránovou filtrací nebo autoklávováním a skladují se v temnu při 4 °C. Zásobní roztok č. 4 by se měl sterilizovat pouze membránovou filtrací. Ředěním těchto roztoků se získají konečné živné koncentrace zkušebních roztoků.
+----------------+--------------------+---------------------+
| Živiny | Koncentrace | Konečné koncentrace |
| | základních roztoků | zkušebních roztoků |
+----------------+--------------------+---------------------+
| Zásobní roztok č. 1: makroživiny |
| | -1 | -1 |
| NH Cl | 1,5 g.1 | 15 mg.1 |
| 4 | | |
| | -1 | -1 |
| MgCl . 6H O | 1,2 g.1 | 12 mg.1 |
| 2 2 | | |
| | -1 | -1 |
| CaCl . 2H O | 1,8 g.1 | 18 mg.1 |
| 2 2 | | |
| | -1 | -1 |
| MgSO . 7H O | 1,5 g.1 | 15 mg.1 |
| 4 2 | | |
| | -1 | -1 |
|KH PO | 0,16 g.1 | 1,6 mg.1 |
| 2 4 | | |
+----------------+--------------------+---------------------+
|Zásobní roztok č. 2: Fe - EDTA |
| | -1 | -1 |
| FeCl . 6H O | 80 mg.1 | 0,08 mg.1 |
| 3 2 | | |
| | -1 | -1 |
| Na EDTA . 2H O | 100 mg.1 | 0,1 mg.1 |
| 2 2 | | |
+----------------+--------------------+---------------------+
| Zásobní roztok č. 3: stopové prvky |
| -1 | -1 |
| H BO | 185 mg.1 | 0,185 mg.1 |
| 3 3 | | |
| | -1 | -1 |
| MnCl . 4H O | 415 mg.1 | 0,415 mg.1 |
| 2 2 | | |
| | -1 | -3 -1 |
| ZnCl | 3 mg.1 | 3 . 10 mg.1 |
| 2 | | |
| | -1 | -3 -1 |
| CoCl . 6H O | 1,5 mg.1 | 1,5 . 10 mg.1 |
| 2 2 | | |
| | -1 | -5 -1 |
| CuCl . 2H O | 0,01 mg.1 | 1 . 10 mg.1 |
| 2 2 | | |
| | -1 | -3 -1 |
| Na MoO . 2H O | 7 mg.1 | 7 . 10 mg.1 |
| 2 4 2 | | |
+----------------+--------------------+---------------------+
| Zásobní roztok č. 4: NaHCO |
| 3 |
| | -1 | -1 |
| Na HCO | 50 g.1 | 50 mg.1 |
| 3 | | |
+----------------+--------------------+---------------------+
Po provzdušnění by mělo mít živné médium hodnotu pH přibližně 8.
1.6.2 Přístroje
- běžné laboratorní vybavení.
- kultivační baňky o vhodném objemu (např. Erlenmayerovy baňky o objemu 250 ml se 100 ml zkoušeného roztoku). Všechny používané baňky by měly být identické co se týče materiálu a rozměrů.
- kultivační zařízení: klimatizovaná místnost nebo box s teplotou 21 - 25 °C ± 2 °C a stálým osvětlením ve spektrálním rozsahu vlnových délek od 400 do 700 nm. Jestliže řasy v kontrolních kulturách dosáhnou doporučené rychlosti růstu, můžeme předpokládat, že podmínky pro jejich růst, včetně intenzity světla jsou odpovídající.
Při průměrných hladinách zkoušených roztoků se doporučuje použít světelnou
-2 -1 18 -2 -1
intenzitu v rozmezí 60 - 120 μE.m .s (35 - 70 . 10 fotonů . m .s )
při měření vhodným zařízením v rozsahu 400 - 700 nm. Při měření intenzity
luxmetry je vyhovující oblast 6000 - 10 000 lx. Této světelné intenzity lze
dosáhnout umístěním čtyř až sedmi 30 W zářivek univerzálního bílého typu
(barevná teplota přibližně 4 300 K) ve vzdálenosti 0,35 m od kultury řas.
- měření hustoty buněk by se mělo provádět přímým počítáním živých buněk, např. pomocí mikroskopu a počítacích komůrek. Za předpokladu dostatečné citlivosti a korelace s buněčnou hustotou mohou být použity i další postupy (fotometrie, turbidimetrie, ...).
1.6.3 Zkušební organismy
Předpokládá se, že použité druhy zelených řas jsou rychle rostoucí, vhodné pro kultivaci a zkoušení. Doporučovány jsou zejména následující druhy:
- Selenastrum capricornutum, např. ATCC 22662 nebo CCAP 278/4,
- Scenedesmus subspicatus, např. 86, 81 SAG.
Poznámka:
ATCC - American Type Culture Collection (U.S.A.)
CCAP = Culture Centre of Algae and Protozoa (U.K.)
SAG = Collection of algal culture (Göttingen, F.R.G.)
Použití jiného druhu řas musí být uvedeno ve zprávě.
1.6.4 Postup zkoušky
Koncentrační rozmezí, ve kterém je účinky látek nejlépe zjišťovat, se určí orientační zkouškou.
Dva způsoby měření růstu (biomasa a rychlost růstu) mohou poskytovat zcela
rozdílné míry inhibice růstu; v orientační vyhledávací zkoušce se použijí
oba, aby mohlo být umožněno se ubezpečit, že geometrický růst koncentrace
dovolí odhadnout jak E C tak E C .
b 50 r 50
Počáteční hustota buněk
Doporučuje se, aby počáteční hustota buněk řasy Selenastrum capricornutum
4
a řasy Scenedesmus subspicatus ve zkušebních roztocích byla přibližně 10
-1
buněk.ml . Použije-li se jiný druh řasy, měla by být počáteční hustota
biomasy srovnatelná.
Koncentrace zkoušené látky
Do zkoušky se nasazuje nejméně pět různých koncentrací zkoušené látky v geometrické řadě s koeficientem nepřevyšujícím 2,2. Nejnižší použitá koncentrace by neměla vykazovat žádný pozorovatelný účinek na růst řas. Nejvyšší zkoušená koncentrace by měla omezit růst ve srovnání s kontrolní zkouškou nejméně o 50 %, nejlépe když však zastaví růst zcela.
Opakování a kontroly
Plán zkoušky musí zahrnovat při opakování každé zkušební koncentrace, tři kontroly a je-li použita pomocná látka též tři kontroly s přídavkem této látky. Je-li pro to důvod, může být plán zkoušky upraven tak, že se použije více koncentračních úrovní a sníží se počet opakování zkoušky v každé nasazené koncentraci.
Provedení zkoušky
Zkušební roztoky o určité koncentraci zkoušené látky se připraví smícháním naředěného množství zásobního roztoku zkoušené látky s roztokem živin, inokula a vody (viz příloha).
Kultivační baňky se protřepají a umístí se do kultivačního zařízení. Řasové buňky se udržují v suspenzi třepáním, mícháním nebo probubláváním vzduchem, čímž se zlepšuje výměna plynů a zmenšují se změny pH zkušebních roztoků. Kultury se inkubují při teplotě 21 - 25 °C udržované s přesností ± 2 °C.
Hustota buněk se v každé baňce odečítá nejméně po 24, 48 a 72 h po zahájení zkoušky. Používá-li se k měření hustoty buněk jiné metody než je jejich přímé počítání použije se jako srovnávací vzorek filtrovaný řasový roztok obsahující příslušnou koncentraci zkoušené chemikálie.
pH se měří na začátku zkoušky a po 72 hodinách.
Hodnota pH by se neměla během zkoušky změnit víc jak o 1,5 jednotky.
Zkoušení těkavých látek
V současné době neexistuje obecně přijatelný způsob zkoušení těkavých látek. Je-li známo, že má látka tendenci se snadno vypařovat, mohou být použity uzavřené kultivační nádoby se zvětšeným parním prostorem. Při stanovování objemu parního prostoru kultivačních baněk se musí zohlednit potřeba odvodu CO2 ze zkoušeného roztoku. Byla navržena řada variant této metody (4).
Měla by být vyvinuta snaha o stanovení množství zkoušené látky, která v roztoku zůstala. V každém případě by měly být výsledky zkoušení těkavých látek v uzavřených systémech mimořádně opatrně.
Limitní zkouška
S využitím postupů popsaných v této metodice se může provádět limitní zkouška při 100 mg.1-1 za účelem prokázání skutečnosti, že EC50 je vyšší než tato koncentrace.
Jestliže je povaha zkoušené látky taková, že nelze ve vodě dosáhnout koncentrace 100 mg.1-1, měla by být provedena limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).
Limitní zkouška by měla být prováděna minimálně ve třech vzorcích se stejným počtem kontrol. Limitní zkouškou by měly být stanoveny obě měřítka růstu (biomasa a rychlost růstu).
V případě, že se limitní zkouškou prokáže pokles růstu biomasy nebo rychlosti růstu o 25 % a více ve srovnání s kontrolními vzorky, je nutné provést úplné zkoušení.