II. Stanovení kyseliny erukové
1. Předmět a rozsah použití
Touto metodou se stanoví obsah kyseliny erukové
- v olejích a tucích obsahujících kyselinu cetolejovou (Z- izomer kyseliny dokosenové, který se vyskytuje v rybích olejích) a
- v hydrogenovaných olejích a tucích obsahujících E- a Z- izomery kyseliny dokosenové.
2. Definice
Pojmem obsah kyseliny erukové se rozumí obsah kyseliny erukové stanovený popsanou metodou.
3. Princip metody
Methylestery jednotlivých mastných kyselin oleje nebo tuku se rozdělí tenkovrstvou argentační chromatografií při nízké teplotě a kvantitativně stanoví plynovou chromatografií s kapalnou stacionární fází.
4. Reakční činidla
4.1. Čerstvě destilovaný diethylether bez peroxidů
4.2. n-hexan
4.3. Silikagel G pro chromatografii na tenké vrstvě
4.4. Silikagel pro kolonovou chromatografii
4.5. Roztok dusičnanu stříbrného o koncentraci 200 g/l. Ve vodě se rozpustí 24 g dusičnanu stříbrného a doplní se vodou na 120 ml.
4.6. Roztok methylesteru kyseliny erukové 5 mg/ml. V několika ml n-hexanu se rozpustí 50 mg methylesteru kyseliny erukové a doplní se n-hexanem do 10 ml.
4.7. Methylester kyseliny tetrakosanové jako vnitřní standardní roztok 0,25 mg/ml.
V několika ml n-hexanu se rozpustí 25 mg methylesteru kyseliny tetrakosanové (jako v bodě 4.6.) a doplní se n-hexanem do 100 ml.
4.8. Vyvíjecí rozpouštědlo: toluen: n-hexan v poměru 90:10 (objemově).
4.9. Roztok 2,7-dichlorfluoresceinu o koncentraci 0,5 g/l. Za současného zahřívání a míchání se rozpustí 50 mg 2,7-dichlorofluoresceinu ve 100 ml 50 % vodného roztoku methanolu.
5. Přístroje a pomůcky
5.1. Zařízení pro chromatografii na tenké vrstvě a dále zejména:
5.1.1. Mrazící jednotka schopná udržet vyvíjecí komoru a její obsah při teplotě od - 20 °C do - 25 °C.
5.1.2. Skleněné desky 200 x 200 mm.
5.1.3. UV lampa
5.1.4. Skleněné kolony o délce asi 200 mm o vnitřním průměru asi 10 mm s filtrem ze skelné vaty nebo s fritou, případně malé nálevky s fritou.
5.1.5. Aplikátor pro nanášení roztoků do úzkého pásku nebo proužku na chromatografické (TLC) desky.
5.2. Plynový chromatograf s kapalnou stacionární fází s elektronickým integrátorem, jak je popsáno v oddílu III přílohy VI k nařízení Komise Evropského hospodářského společenství č. 72/77.
6. Postup
6.1. Příprava methylesterů mastných kyselin
Z přibližně 400 mg olejové nebo tukové složky zkoušeného vzorku se připraví roztok obsahující asi 20 až 50 mg/ml methylesterů mastných kyselin v n-hexanu metodou popsanou v oddílu II odst. 3 přílohy VI k nařízení Komise Evropského hospodářského společenství č. 72/77.
6.2. Chromatografie na tenké vrstvě
6.2.1. Příprava desek
Do 500 ml baňky s kulatým dnem se vsype 60 g silikagelu (4.3.), přidá se 120 ml roztoku dusičnanu stříbrného (4.5.) a třepe se 1 min do vytvoření zcela homogenní suspenze. Tato suspenze se poté nanese obvyklým způsobem na desky. Tloušťka vrstvy musí být přibližně 0,5 mm. Toto množství suspenze je dostatečné pro přípravu pěti desek o rozměrech 200 x 200 mm.
Desky se nechají částečně vyschnout na vzduchu (nejlépe v temnu po dobu asi 30 min). Desky se úplně vysuší a aktivují v sušárně po dobu 2,5 h při teplotě 100 °C. Po aktivaci se desky co nejdříve použijí nebo se přechovávají v temnu a před použitím se znovu aktivují. Dostačující je aktivace při 110 °C po dobu 1 h, pokud ovšem přitom deska neztmavne. Před použitím se v nanesené vrstvě sorbentu vyryjí rýhy 10 mm od postranních okrajů a od horního okraje každé desky, aby se v průběhu vyvíjení snížily okrajové efekty.
6.2.2. Nanášení methylesterů
Aplikátorem (5.1.5.) se nanese do úzkého, asi 50 mm dlouhého proužku, nejméně 40 mm od okraje desky a 10 mm od spodního okraje desky 50 μl roztoku methylesterů (6.1.) připravených ze vzorku. Podobným způsobem se nanese 100 μl směsného roztoku obsahujícího stejné objemy připraveného roztoku methylesterů (6.1.) a roztoku methylesteru kyseliny erukové (4.6.). Vzhledem ke křehkosti nanesené vrstvy sorbentu se postupuje při nanášení roztoků zvláště opatrně. Na desku lze případně nanést také 50 μl roztoku methylesteru kyseliny erukové (4.6.), který po vyvíjení pomůže při identifikaci proužku methylesteru kyseliny erukové. Po nanesení methylesterů se spodní okraj desky postaví do diethyletheru na dobu, než ether dostoupí asi 5 mm nad zónu nanesených vzorků. Tak se methylestery koncentrují v úzkém proužku.
6.2.3. Vyvíjení desek
Do vyvíjecí komory se nalije vyvíjecí rozpouštědlo do výšky asi 5 mm (4.8.) a komora uzavřená víčkem se uloží do mrazící jednotky (5.1.1.) udržované při teplotě - 25° C nebo co nejblíže této teploty. V některých případech může být vhodné vyvíjecí komoru obložit. Po dvou hodinách se deska opatrně umístí do komory a rozpouštědlo se nechá stoupat asi do jedné poloviny až dvou třetin výšky desky. Deska se vyjme a rozpouštědlo se z ní jemně odpaří v proudu dusíku. Deska se znovu vloží do komory a rozpouštědlo se ponechá stoupat až k vrchnímu okraji desky. Deska se vyjme a jako v předchozím případě se vysuší v proudu dusíku a poté se opatrně postříká roztokem 2,7-dichlorfluoresceinu (4.9.).
Deska se prohlédne pod ultrafialovým světlem a pruh obsahující methylester kyseliny erukové ve vzorku se určí zvýrazněným pruhem vzorku, ke kterému byl přidán methylester kyseliny erukové.
6.2.4. Rozdělení methylesterů
Proužek methylesteru kyseliny erukové pocházející ze vzorku se seškrábne do 50 ml kádinky tak, aby nedošlo ke ztrátám. Obdobně se do jiné 50 ml kádinky přenese silikagel umístěný nad a pod proužkem methylesteru kyseliny erukové. Tento pruh obsahuje všechny ostatní frakce methylesterů mastných kyselin. Do každé kádinky se přidá 1,0 ml standardního roztoku methylesteru kyseliny tetrakosanové (4.7.) a 10 ml diethyletheru (4.1.). Obsah kádinek se promíchá a přenese se na separační kolony či nálevky (5.1.4.), z nichž každá obsahuje asi 1 g silikagelu (4.4.). Methylestery se extrahují třemi nebo čtyřmi 10 ml dávkami diethyletheru a eluáty se zachycují do malých baněk. Každý filtrát se odpaří na malý objem v proudu dusíku a methylestery se přelijí do malých zkumavek s kónickým dnem. Zbytek rozpouštědla se odpaří v proudu dusíku tak, aby se methylestery zkoncentrovaly na dně zkumavek. Methylestery se rozpustí v 25 - 50 μl n-hexanu (4.2.).
6.3. Plynová chromatografie s kapalnou stacionární fází
6.3.1. Provede se postup popsaný v oddílu III přílohy VI k nařízení Komise Evropského hospodářského společenství č. 72/77 a zkouší se 1 - 2 μl roztoků methylesterů získaných z frakce obsahující methylester kyseliny erukové a z frakcí obsahujících zbytek methylesterů mastných kyselin.
6.3.2. Elektronickým integrátorem se stanoví následující plochy píků:
- z chromatogramu frakce obsahující methylester kyseliny erukové plochy píků methylesteru kyseliny erukové (E), vnitřního standardu (L1), celkových methylesterů s výjimkou vnitřního standardu (EF),
- z chromatogramu frakcí obsahujících zbytek methylesterů mastných kyselin plochy píků celkových methylesterů mimo vnitřního standardu (RF) a vnitřního standardu (L2).
7. Vyjádření výsledků
7.1. Metoda výpočtu a vzorec
7.1.1. Obsah kyseliny erukové ve vzorku vyjádřený jako procentní podíl methylesteru kyseliny erukové z celkových methylesterů mastných kyselin připravených ze vzorku je dán vzorcem:
E
----------- x 100
EF RF
L (-- + --)
1 L L
1 2
kde
E, EF, RF, L1 a L2 jsou plochy píků podle 6.3.2., v případě nutnosti korigované kalibračními faktory.
Obsah methylesteru kyseliny erukové daný výše uvedeným vzorcem odpovídá obsahu kyseliny erukové vyjádřenému v procentech z celkového množství mastných kyselin ve vzorku.
7.1.2. Jestliže jsou plochy píků vyjádřeny v procentech, pak lze hodnoty EF a RF vypočítat následovně:
EF = 100-L
1
RF = 100-L
2
7.1.3. Metoda výpočtu podle odstavce 7.1.1. předpokládá, že množství kyseliny tetrakosanové ve vzorku je zanedbatelné. Jestliže se ukáže, že ve vzorku je významné množství této kyseliny, hodnota pro kyselinu tetrakosanovou (L2) získaná z chromatogramu frakcí obsahujících zbylé methylestery mastných kyselin musí být snížena takto:
L - T
2 2
kde
T P
0 2
T = ----
2 P
0
kde
T2 je plocha píku methylesteru kyseliny tetrakosanové pocházející ze vzorku, tvořící část plochy píku vnitřního standardu v chromatogramu zbývající frakce methylesterů mastných kyselin,
P2 je plocha píku methylesteru kyseliny palmitové z chromatogramu zbylé frakce,
T0 je plocha píku methylesteru kyseliny tetrakosanové z chromatogramu methylesterů celkových mastných kyselin stanovených metodou zkoušení podle článku 2 Směrnice Komise 80/891/EHS,
P0 je plocha píku methylesteru kyseliny palmitové z chromatogramu methylesterů celkových mastných kyselin stanovených metodou zkoušení podle článku 2 Směrnice Komise 80/891/EHS.
7.1.4. Odvození vzorce
Podíl mastných kyselin ve frakci obsahující methylester kyseliny erukové vyjádřený v procentech z celkového obsahu mastných kyselin ve vzorku je dán vzorcem:
EF
--
L
1 EF
------- x 100 nebo ----------- x 100
EF RF EF RF
-- + -- L (-- + --)
L L 1 L L
1 2 1 2
Podíl kyseliny erukové ve frakci obsahující methylester kyseliny erukové je dán vztahem:
E
--
EF
Odtud obsah kyseliny erukové ve vzorku vyjádřený v procentech z celkového obsahu mastných kyselin je dán vztahem:
EF E E
----------- x -- x 100 nebo ----------- x 100
EF RF EF EF RF
L (-- + --) L (-- + --)
1 L L 1 L L
1 2 1 2
7.1.5. Opakovatelnost
Rozdíl mezi výsledky získanými ze dvou stanovení provedených současně nebo rychle po sobě ze stejného vzorku stejným pracovníkem za stejných podmínek nesmí být větší než 10 % výsledné hodnoty nebo 0,5 g na 100 g vzorku. Rozhodující je vyšší hodnota.
------------------------------------------------------------------