Příloha č. 3
Provádění zkoušky ekotoxicity
1. Zkoušky s bakteriemi, perloočkou a řasami se provádějí s vodným výluhem pevného odpadu nebo s kapalným odpadem, zkouška se salátem se provádí s pevným nebo kapalným odpadem.
2. Koncentrace zkoušeného vzorku pevného odpadu činí 10 % hm. vzorku, tj. 100 g sušiny odpadu + 900 g sušiny umělé půdy. Umělá půda slouží zároveň jako kontrola.
3. Kapalný odpad mísitelný s vodou se filtruje membránovým filtrem 0,45 μm v souladu s normou ČSN EN 14735 Charakterizace odpadů - Charakterizace odpadů - Příprava vzorků odpadu pro testy ekotoxicity a používá se ředěný na koncentraci 100 g/l s přidáním stejných živin a ve stejné koncentraci jako v kontrole podle odpovídající technické normy. Dále se postupuje podle bodu 4. S kapalným odpadem nemísitelným s vodou se akvatické zkoušky neprovádějí v souladu s normou ČSN EN 14735. Kapalný odpad se aplikuje v množství 100 g do 900 g sušiny umělé půdy.
4. Vodný výluh pevného odpadu se používá ředěný (při koncentraci 100 ml/l) s přidáním stejných živin a ve stejné koncentraci jako v kontrole, podle odpovídající technické normy. V případě zkoušky s luminiscenčními bakteriemi Aliivibrio fischeri to znamená, že se k 0,5 ml ředěného vzorku (koncentrace 200 ml/l) s upravenou salinitou podle pokynů uvedených v technické normě ČSN EN ISO 11348 Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou emisi Vibrio fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) -1,2 a dodatku Změna A 01/19 Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou emisi Aliivibrio fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) - část 1: Metoda s čerstvě připravenými bakteriemi, část 2: Metoda se sušenými bakteriemi přidá 0,5 ml suspenze bakterií (zkoušená koncentrace vzorku je 100 ml/l). V případě zkoušky s řasami Desmodesmus subspicatus se použije vodný výluh o koncentraci 100 ml/l, s přídavkem živin, přídavek řasové suspenze nesmí být větší než 1 % objemu zkoušeného vzorku.
5. Příprava výluhu:
Při přípravě výluhu se postupuje podle ČSN EN 12457-4 ze dne 1. července 2003 Charakterizace odpadů - Vyluhování - Ověřovací zkouška vychovatelnosti zrnitých odpadů a kalů - Část 4: Jednostupňová vsádková zkouška při poměru kapalné a pevné fáze 10 l/kg pro materiály se zrnitostí menší než 10 mm (bez zmenšení velikosti částic, nebo s ním).
Pro filtraci se použijí membránové filtry 0,45 μm z PTTE nebo nylonu místo filtrů z acetylcelulózy nebo nitrocelulózy.
6. V případě odpadů obsahujících anorganická pojivá (vápno, hydraulické vápno, cement a další silikáty) může být pH výluhu upraveno na hodnotu odpovídající doporučenému pH v netoxické kontrole podle odpovídající technické normy a pH pevného vzorku pro zkoušku se salátem může být upraveno roztokem kyseliny sírové na hodnotu 6,0 ± 0,5. Koncentrace kyseliny potřebná k úpravě hodnoty pH vzorku má být taková, aby změna objemu byla co nejmenší. Přídavek kyseliny nemá způsobit srážení nebo komplexaci, v takovém případě se úprava pH neprovádí.
7. Doplňující podmínky pro provedení zkoušky se zkušebním organismem Salát Lactuca sativa podle technické normy ČSN EN ISO 11269-1 Kvalita půdy - Stanovení účinků znečišťujících látek na půdní flóru - Část 1: Metoda měření inhibice růstu kořene:
Zkouška se provede se semeny salátu hlávkového k rychlení Lactuca sativa var. capitata, Safír. Pro zkoušku se vybírají nepoškozená semena stejné velikosti, chemicky neošetřená. Semena salátu se nechají předklíčit ve zkušební nádobě na vrstvě filtračního papíru zvlhčeného vodou po dobu 24 až 48 h, při laboratorní teplotě, bez regulace osvětlení. Pro zkoušku se vybírají naklíčená semena, popř. s kořínkem, který je kratší než 2 mm.
Do zkušební nádoby se naváží 200 až 300 g zvlhčeného zkoušeného vzorku odpadu (ředěného v hmotnostním poměru 1:9 umělou půdou) nebo kontroly (umělá půda). Výška vrstvy vzorku v nádobě musí být minimálně 3 cm. Rozvrhne se pravoúhlá síť, např. 5 x 3 body. Do vytvořených jamek asi 0,5 až 1 cm hlubokých se pinzetou rovnoměrně rozmístí po 15 naklíčených semenech salátu, kořínkem směrem dolu. Semena se ke vzorku přitlačí, vzorkem se nezakrývají a takto připravené nádoby uzavřené víkem se umístí do termostatu s teplotou 24 ± 2 °C bez přístupu světla.
Zkouška se provádí ve třech paralelních stanoveních. Po 120 ± 2 h inkubace se salát šetrně oddělí od vzorku a změří se a zaznamenává délka všech kořenů ve zkoušeném vzorku a v kontrole s přesností na 1 mm.
Základem pro hodnocení zkoušky inhibice růstu je průměrná délka kořene zjištěná v kontrole a zkoušeném vzorku. Jestliže předklíčené semeno nevytvoří kořínek, započítává se tato hodnota do střední hodnoty jako nulová. Variační koeficient paralelních stanovení nesmí překročit 20 %. Průměrná délka kořene salátu v kontrole musí být minimálně 15 mm.
Doporučuje se pravidelně provádět zkoušku s referenční látkou. Stanovuje se
EC
50
kyseliny borité za použití umělé půdy, přičemž doporučená hodnota
EC
50
se pohybuje v rozmezí
300 mg.kg až 650 mg.kg .
-1 -1
suš suš
Aby se prokázala jednotnost laboratorních zkušebních podmínek, jsou do každé zkoušky inhibice růstu kořene zahrnuty tři zkušební nádoby naplněné pískem, po 6 semenech předklíčeného salátu.
Vyhodnocení zkoušky se provádí v souladu s normou ČSN EN ISO 11269-1 Kvalita půdy - Stanovení účinků znečišťujících látek na půdní flóru - Část 1: Metoda měření inhibice růstu kořene. Doporučená střední hodnota délky kořene je 30 mm.