6. Postup
6.1 Příprava vzorku
6.1.1 Příprava vzorku bez přidání vnitřního standardu
Do Erlenmeyerov baňky na 100 ml se zábrusovou zátkou se odváží asi 1,0 g vzorku přesně. Do baňky se pipetou přidá 1,0 ml roztoku kyseliny sírové (4.14) a 50,0 ml směsi ethanol/voda (4.15). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (5.5), baňka se uzavře a silně se protřepe, dokud nevznikne homogenní suspenze. Protřepává se alespoň 1 minutu. Baňka se vloží na 5 minut do vodní lázně (5.1) o teplotě 60 °C ± 1 °C, aby se podpořila extrakce konzervantů do ethanolové fáze.
Baňka se ihned ochladí pod proudem studené vody a extrakt se uloží na jednu hodinu do ledničky. Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír. Asi 2 ml filtrátu se převedou do 5 ml vzorkovací lahvičky. Extrakty se uloží do chladničky a stanovení metodou HPLC se provede do 24 hodin.
6.1.2 Příprava vzorků včetně přidání vnitřního standardu
Do Erlenmeyerov baňky na 100 ml se zábrusovou zátkou se s přesností na tři desetinná místa odváží 1,0 g ± 0,1 g vzorku.
Do baňky se pipetou přidá 1,0 ml roztoku kyseliny sírové (4.14) a 40,0 ml směsi ethanol/voda (4.15). Přidá se přibližně 1 g varných kamínků (5.5) a přesně 10,00 ml roztoku vnitřního standardu. Baňka se uzavře a silně se protřepe, dokud nevznikne homogenní suspenze. Protřepává se alespoň 1 minutu. Baňka se vloží na 5 minut do vodní lázně (5.1) o teplotě 60 °C ± 1 °C, aby se podpořila extrakce konzervantů do ethanolové fáze.
Baňka se ihned ochladí pod proudem studené vody a extrakt se uloží na jednu hodinu do chladničky. Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír.
Asi 2 ml filtrátu se převedou do 5 ml vzorkovací lahvičky (zkušební roztok). Extrakt se uloží do chladničky a stanovení metodou HPLC se provede do 24 hodin.
6.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)
6.2.1 Chromatografické podmínky
- Mobilní fáze: směs tetrahydrofuran/voda/methanol/acetonitril (4.17)
- Průtoková rychlost: 1,5 ml/min
- Detekční vlnová délka: 280 ran
6.2.2 Kalibrace
Nastříkne se 10 μl každého ze standardních roztoků konzervantů (4.19). Ze získaných chromatogramů se stanoví poměr výšek píku standardních roztoků konzervantů k píku vnitřního standardu. Pro každý konzervant se sestrojí křivka závislosti těchto poměrů na koncentraci standardních roztoků.
6.2.3 Stanovení
Do chromatogafu se nastříkne 10 μl roztoku vzorku bez vnitřního standardu (6.1.1) a zaznamená se chromatogram.
Nastříkne se 10 μl jednoho ze standardních roztoků konzervantu (4.19) a zaznamená se chromatogram. Získané chromatogramy se porovnají.
Není-li v chromatogramu extraktu vzorku (6.1.1) přítomen pík s přibližně stejným retenčním časem, jako je retenční čas píku isopropylparabenu (doporučený vnitřní standard), pokračuje se nastříknutím 10 μl roztoku vzorku s vnitřním standardem (6.1.2). Chromatogram se zaznamená a změří se výšky píku.
Je-li v chromatogramu roztoku vzorku rušivý pík s retenčním časem přibližně stejným jako retenční čas isopropylparabenu, měl by být vybrán jiný vnitřní standard.
Není-li jeden z vyšetřovaných konzervantu v chromatogramu vzorku přítomen, lze tento konzervant použít jako vnitřní standard.
Vypočítají se poměry výšek píku vyšetřovaných konzervantu k výšce píku vnitřního standardu.
Je třeba ověřit, že kalibrační křivka použitého standardu je lineární.
Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:
- separace píku nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice separace píku je uveden na obrázku 16.)
separace píků (p)
p = f/g
Obrázek 16 - Separace píků
Není-li požadované separace dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona, nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn.
- faktor asymetrie
(A )
s
všech získaných píku by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 17.) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost zaznamenávání 2 cm/min.
Faktor asymetrie
(A )
s
A = b/a
s
Obrázek 17 - Faktor asymetrie píku
- Základna by měla být stabilní.