5. Postup

5. Postup

5.1 Příprava vzorku

Do odměrné baňky na 50 ml se s přesností na tři desetinná místa naváží 1 ± 0,1 g (a gramů) vzorku. Vzorek se rozptýlí ve 25 ml směsi voda/methanol (3.8). Baňka se uzavře a silně se protřepe, dokud se nevytvoří homogenní suspenze. Protřepává se alespoň 1 minutu. Baňka se umístí do vodní lázně (4.1) nastavené na 60 °C, aby se usnadnila extrakce. Baňka se ochladí a doplní se na objem směsí voda/methanol (3.8). Extrakt se zfiltruje přes filtrační papír (4.4). Kvalitativní stanovení HPLC se provede do 24 hodin od přípravy extraktu.

5.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

5.2.1 Průtoková rychlost mobilní fáze (3.9) se upraví na 1,0 ml/min a vlnová délka detektoru se nastaví na 295 nm.

5.2.2 Nastříkne se 10 μl roztoku vzorku získaného podle bodu 5.1 a zaznamená se chromatogram. Změří se plochy píku. Provede se kalibrace podle bodu 5.2.3. Porovnají se chromatogramy získané pro vzorek a standardní roztoky. Pro výpočet koncentrace analytu v roztoku vzorku se použijí plochy píku a faktory odezvy (RF) vypočtené podle 5.2.3.

5.2.3 Kalibrace

Nastříkne se 10 μl standardního roztoku (3.10) a zaznamená se chromatogram. Nástřik se provede několikrát, dokud není plocha píku konstantní.

Stanoví se faktor odezvy RF :

i

p

i

RF = --

i c

i

kde

p = plocha píku pro hydrochinon, hydrochinon-

i monomethylether, hydrochinon- monoethylether nebo

hydrochinon- monobenzylether

c = koncentrace hydrochinonu, hydrochinon-

i monomethyletheru, hydrochinon-monoethyletheru nebo

hydrochinon-monobenzyletheru v standardním roztoku

(3.10) (g/50 ml).

Je třeba ověřit, zda chromatogramy získané pro standardní roztok a roztok vzorku splňují následující požadavky:

- rozlišení píku nejhůře odděleného páru je alespoň 0,90. (Definice rozlišení píku je uvedena na obrázku 14);

f

p = -

g

Obrázek 14 - Rozlišení píků

Není-li požadovaného rozlišení dosaženo, měla by být buď použita účinnější kolona nebo by mělo být složení mobilní fáze upraveno tak, aby byl požadavek splněn;

- faktor asymetrie

A

s

všech získaných píku by se měl pohybovat od 0,9 do 1,5. (Definice faktoru asymetrie je uvedena na obrázku 15) Při zaznamenání chromatogramu za účelem stanovení faktoru asymetrie je doporučená rychlost zaznamenávání 2 cm/min.

Obrázek 15 - Faktor asymetrie píku

- Základna musí být stabilní.