5. Kvantitativní stanovení za přítomnosti donoru formaldehydu
5.1 Princip
Oddělený formaldehyd se převede na žlutý derivát lutidinu reakcí s pentan-2,4-dionem v reaktoru za kolonou a absorbance vzniklého derivátu se měří při 420 nm.
5.2 Použité chemikálie
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p. a. nebo vyšší
5.2.1 Voda čistoty pro HPLC nebo voda ekvivalentní kvality
5.2.2 Bezvodý octan amonný
5.2.3 Koncentrovaná kyselina octová
5.2.4 Pentan-2,4-dion (uchovává se při 4 °C)
5.2.5 Bezvodý hydrogenfosforečnan sodný
5.2.6 Kyselina trihydrogenfosforečná, 85%
20
(d = 1,7)
4
5.2.7 Methanol čistoty pro HPLC
5.2.8 Dichlormethan
5.2.9 Formaldehyd, 37 % až 40 % (m/V)
5.2.10 Hydroxid sodný, 1 mol/l
5.2.11 Kyselina chlorovodíková, 1 mol/l
5.2.12 Kyselina chlorovodíková, 0,002 mol/l
5.2.13 Roztok škrobu čerstvě připravený podle European Pharmacopoeia (viz 4.2.8)
5.2.14 Odměrný roztok jodu, 0,05 mol/l
5.2.15 Odměrný roztok thiosíranu sodného, 0,1 mol/l
5.2.16 Mobilní fáze:
Vodný roztok hydrogenfosforečnanu sodného (5.2.5), 0,006 mol/l, upravený na pH 2,1 kyselinou trihydrogenfosforečnou (5.2.6)
5.2.17 Činidlo do reaktoru za kolonou:
V odměrné baňce na 1000 ml se rozpustí:
- 62,5 g octanu amonného (5.2.2),
- 7,5 ml kyseliny octové (5.2.3),
- 5 ml pentan-2,4-dionu (5.2.4).
Objem se doplní po rysku vodou (5.2.1).
Roztok se uchovává ve tmě.
Skladovatelnost: nejvýše tři dny při 25 °C.
Barva roztoku by se neměla měnit.
5.2.18 Standardní roztok formaldehydu: zásobní roztok
10 g roztoku formaldehydu (5.2.9) se převede do odměrné baňky na 1000 ml a doplní se vodou na 1000 ml.
Koncentrace tohoto roztoku se stanoví takto:
Odebere se 5,00 ml; přidá se 25,00 ml odměrného roztoku jodu (5.2.14) a 10,00 ml roztoku hydroxidu sodného (5.2.10).
Nechá se stát 5 minut.
Okyselí se 11,00 ml HCl (5.2.11) a přebytek jodu se titruje odměrným roztokem thiosíranu sodného (5.2.15), jako indikátor se použije roztok škrobu (5.2.13).
Spotřeba 1 ml odměrného roztoku jodu (5.2.14) odpovídá 1,5 mg formaldehydu.
5.2.19 Standardní roztok formaldehydu: zředěný roztok
Zásobní roztok formaldehydu se zředí v poměru 1/100 mobilní fází (5.2.16). 1 ml výsledného roztoku obsahuje asi 37 μg formaldehydu.
Přesný obsah se vypočte.
5.3 Přístroje a pomůcky
5.3.1 Obvyklé laboratorní vybavení
5.3.2 Bezpulzní čerpadlo pro HPLC
5.3.3 Nízkotlaké bezpulzní čerpadlo pro činidlo (případně druhé čerpadlo pro HPLC)
5.3.4 Nastřikovací ventil se smyčkou o objemu 10 μl
5.3.5 Reaktor za kolonou obsahující následující prvky:
+ jednolitrová tříhrdlá baňka,
+ jednolitrové topné hnízdo,
+ dvě kolony Vigreux o minimálně 10 patrech, vzduchem chlazené,
+ trubice z nerezové oceli (sloužící jako výměník tepla) 1,6 mm, vnitřní průměr 0,23 mm, délka 400 mm,
+ teflonová trubice 1,6 mm, vnitřní průměr 0,23 mm, délka 5 m (francouzské pletivo - viz příloha 1),
+ jeden díl ve tvaru T bez mrtvého objemu (Valco nebo ekvivalentní),
+ tři spojky bez mrtvého objemu,
nebo: jeden modul za kolonou Applied Biosystems PCRS 520 nebo ekvivalentní s reaktorem o objemu 1 ml.
5.3.6 Membránový filtr, velikost pórů 0,45 μm
5.3.7 Patrona SEP-PAK→
C
18
nebo ekvivalentní
5.3.8 Hotové kolony:
- Bischoff Hypersil RP 18 (typ NC číslo C 25.46 1805), (5 μm, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm),
- nebo DuPont, Zorbax ODS (5 μm, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm),
- nebo Phase SEP, spherisorb ODS 2 (5 μm, délka 250 mm, vnitřní průměr 4,6 mm).
5.3.9 Předkolona
Bischoff
K
1
hypersil RP 18 (typ K1 G 6301 1805) (5 μm, délka 10 mm) nebo ekvivalentní.
5.3.10 Kolona a předkolona se spojí systémem Ecotube (typ A 15020508 Bischoff) nebo ekvivalentním.
5.3.11 Aparatura (5.3.3) se sestaví podle blokového schématu v příloze 2.
Spoje za nastřikovacím ventilem musí být co nejkratší. V tomto případě má trubka z nerezové oceli mezi výstupem z reaktoru a vstupem do detektoru ochladit směs před detekcí; teplota detektoru není známa, aleje konstantní.
5.3.12 Detektor pro viditelnou a UV oblast
5.3.13 Zapisovač
5.3.14 Odstředivka
5.3.15 Ultrazvuková lázeň
5.3.16 Vibrační míchadlo (Vortex nebo ekvivalentní)
5.4 Postup
5.4.1 Kalibrační křivka
Sestrojí se vynesením výšek píků jako funkce koncentrace zředěných formaldehydových kalibračních roztoků.
Kalibrační roztoky se připraví zředěním standardního roztoku formaldehydu (5.2.19) mobilní fází (5.2.16):
- 1,00 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 20,00 ml (asi 185 μg/100 ml)
- 2,00 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 20,00 ml (asi 370 μg/100 ml)
- 5,00 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 25,00 ml (asi 740 μg/100 ml)
- 5,00 ml roztoku (5.2.19) se zředí na 20,00 ml (asi 925 μg/100 ml).
Kalibrační roztoky se ponechají asi jednu hodinu stát při pokojové teplotě a musí být čerstvě připraveny. Kalibrační křivka je lineární pro koncentrace od 1,00 do 15,00 μg/ml.
5.4.2 Příprava vzorků
5.4.2.1 Emulze (krémy, make-up, oční stíny)
Do odměrné baňky na 100 ml s uzávěrem se s přesností na 0,001 g naváží zkušební vzorek (m gramů) odpovídající očekávanému obsahu 100 μg formaldehydu. Přidá se přesně 20,00 ml dichlormethanu (5.2.8) a 20,00 ml kyseliny chlorovodíkové (5.2.12). Promíchá se pomocí vibračního míchadla (5.3.16) a v ultrazvukové lázni (5.3.15). Fáze se oddělí odstředěním (2 minuty při 3000 g). Mezitím se promyje patrona (5.3.7) 2 ml methanolu (5.2.7) a kondicionuje se 5 ml vody (5.2.1). Kondicionovanou patronou se nechají protéci 4 ml vodné fáze extraktu, první dva mililitry se odstraní a následující podíl se zachytí.
5.4.2.2 Pleťové lotiony, šampony
Do odměrné baňky na 100 ml s uzávěrem se s přesností na 0,001 g naváží zkušební vzorek (m gramů) odpovídající očekávanému obsahu 500 μg formaldehydu.
Doplní se po rysku mobilní fází (5.2.16).
Roztok se zfiltruje přes filtr (5.3.6) a nastříkne, nebo se nechá protéci patronou předem kondicionovanou podle bodu 5.4.2.1. Všechny roztoky musí být nastříknuty ihned po přípravě.
5.4.3 Chromatografické podmínky
- Průtok mobilní fáze: 1,0 ml/min,
- Průtok činidla: 0,5 ml/min,
- Celkový průtok na výstupu z detektoru: 1,5 ml/min,
- Objem nástřiku: 10 μl,
- Eluční teplota: u obtížných separací se kolona ponoří do ledové lázně a vyčká se do ustálení teploty (15 až 20 minut),
- Teplota reakce za kolonou: 100 °C,
- Detekce: při 420 nm.
Poznámka: Celý chromatografický systém a systém za kolonou je nutno po použití propláchnout vodou (5.2.1). Nepoužije-li se systém do dvou dnů, musí po tomto proplachu následovat ještě propláchnutí methanolem (5.2.7). Před novým kondicionováním se systémem nechá protéci voda, aby se zabránilo rekrystalizaci.
5.5 Výpočet
Emulze: (5.4.2.1):
Obsah formaldehydu v % (m/m):
-6 -4
C x 10 x 100 C x 10
-------------- = --------
5 m 5 m
Pleťové lotiony a šampony:
V tomto případě platí vzorec:
-6 -4
C x 10 x 100 C x 10
-------------- = --------
m m
kde
m = hmotnost analyzovaného vzorku v g (5.4.2.1),
C = koncentrace formaldehydu v μg/100 ml odečtená z kalibrační
křivky (5.4.1).
5.6 Opakovatelnost
Pro výrobky obsahující asi 0,05 % (m/m) formaldehydu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,001 %.
Pro výrobky obsahující asi 0,2 % (m/m) formaldehydu nesmí rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení na stejném vzorku překročit absolutní hodnotu 0,005 %.