5. Kvantitativní stanovení
(Stanovení kyseliny thioglykolové se provádí s dosud nepoužitým výrobkem z čerstvě otevřeného obalu, aby se zamezilo oxidaci.)
Stanovení musí vždy začínat jodometrií.
5.1 Jodometrie
5.1.1 Princip
Stanovení se provádí oxidací skupiny ,,-SH" jodem v kyselém prostředí podle rovnice:
- +
2 HOOC - CH SH + I → (HOOC - CH - S) + 2I + 2 H
2 2 2 2
5.1.2 Použité chemikálie
Jod, 0,05 mol/l odměrný roztok
5.1.3 Přístroje a pomůcky
Obvyklé laboratorní vybavení
5.1.4 Postup
Do Erlenmeyerovy baňky na 150 ml s uzávěrem, obsahující 50 ml destilované vody, se přesně naváží 0,5 až 1 g vzorku. Přidá se 5 ml kyseliny chlorovodíkové (4.1.1.2) (pH roztoku asi 0) a titruje se roztokem jodu (5.1.2), dokud se neobjeví žluté zabarvení. Lze použít také indikátor (např. roztok škrobu nebo tetrachlormethan).
5.1.5 Výpočet
Obsah kyseliny thioglykolové se vypočte podle vzorce:
92 x n x 100 0,92 n
% (m/m) = ------------- = ------
1000 x 10 x m m
kde:
m = hmotnost zkušebního vzorku (v g),
n = objem spotřebovaného roztoku jodu (5.1.2).
5.1.6 Poznámky
Je-li vypočtený výsledek pro kyselinu thioglykolovou nejméně o 0,1 % nižší než nejvyšší povolená koncentrace, není další stanovení nutné. Jestliže se výsledek rovná nebo je vyšší než povolená maximální koncentrace a kvalitativní stanovení odhalilo přítomnost několika redukčních činidel, je nezbytné provést stanovení plynovou chromatografií.
5.2 Plynová chromatografie
5.2.1 Princip
Kyselina thioglykolová se oddělí od pomocných látek vysrážením roztokem octanu kademnatého. Po methylaci diazomethanem, který se buď připraví in situ nebo předem jako roztok v diethyletheru, se methylderivát kyseliny thioglykolové stanoví chromatografií plyn/kapalina s methyl-oktanoátem jako vnitřním standardem.
5.2.2 Použité chemikálie
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p. a. nebo vyšší
5.2.2.1 Kyselina thioglykolová, 98 %
5.2.2.2 Kyselina chlorovodíková,
20
(d = 1,19 g/ml)
4
5.2.2.3 Methanol
5.2.2.4 Octan kademnatý, dihydrát, 10 % roztok (m/V) ve vodě
5.2.2.5 Methyl-oktanoát, 2 % roztok (m/V) v methanolu
5.2.2.6 Acetátový tlumivý roztok (pH 5):
Octan sodný, trihydrát, 77 g.
Kyselina octová (ledová), 27,5 g.
Demineralizovaná voda do konečného objemu jeden litr.
5.2.2.7 Kyselina chlorovodíková, čerstvě připravený 3M roztok v methanolu (5.2.2.3)
5.2.2.8 1-methyl-3-nitro-l-nitrosoguanidin
5.2.2.9 Hydroxid sodný, 5M roztok
5.2.2.10 Jod, 0,05M odměrný roztok
5.2.2.11 Diethylether
5.2.2.12 Roztok diazomethanu připravený
z N-methyl-N-nitrosotoluen-4-sulfonamidu (Fieser, Reagents for Organic Synthesis (Wiley), 1967)
Získaný roztok obsahuje asi 1,5 g diazomethanu ve 100 ml diethyletheru. Protože diazomethan je toxický a velmi nestabilní plyn, je třeba všechny operace provádět v dobře táhnoucí digestoři, a je třeba se vyvarovat použití zábrusové aparatury (pro tento účel jsou k dispozici speciální soupravy).
5.2.3 Přístroje a pomůcky
5.2.3.1 Obvyklé laboratorní vybavení
5.2.3.2 Aparatura pro přípravu diazomethanu pro methylaci in situ (viz Faleš, H. M., Jaouni, T .M. a Babashak, J. F., Analyt. Chem. 1973, 45, 2302)
5.2.3.3 Přístroj pro přípravu diazomethanu předem (podle Fiesera)
5.2.4 Příprava vzorku
Do centrifugační kyvety na 50 ml se přesně naváží dostatek vzorku, aby obsahoval předpokládané množství 50 až 70 mg kyseliny thioglykolové. Okyselí se několika kapkami kyseliny chlorovodíkové (5.2.2.2), aby se dosáhlo pH asi 3.
Přidá se 5 ml demineralizované vody a 10 ml acetátového tlumivého roztoku (5.2.2.6).
Pomocí pH papírku se ověří, zda je hodnota pH asi 5. Poté se přidá 5 ml roztoku octanu kademnatého (5.2.2.4).
Vyčká se 10 minut a poté se odstřeďuje nejméně 15 minut při 4000 g. Odstraní se supernatant, který může obsahovat nerozpustný tuk (v případě krémových prostředků). Tento tuk nelze zaměňovat s thioly, které se hromadí jako kompaktní hmota na dně nádobky. Ověří se, že se po přidání několika kapek roztoku octanu kademnatého (5.2.2.4) k supernatantu netvoří sraženina.
Jestliže předchozí kvalitativní stanovení neodhalilo přítomnost jiných redukčních činidel než thiolů, ověří se jodometricky, že množství thiolu přítomného v supernatantu nepřekračuje 6 až 8 % původního množství.
Do centrifugační zkumavky obsahující sraženinu se přidá 10 ml methanolu (5.2.2.3) a sraženina se jemně rozptýlí tyčinkou. Znovu se odstřeďuje nejméně 15 minut při 4000 g. Supernatant se slije a ověří se, že neobsahuje thioly.
Sraženina se ještě jednou stejným postupem promyje.
Do téže centrifugační kyvety se přidá
- 2 ml roztoku methyl-oktanoátu (5.2.2.5),
- 5 ml kyseliny chlorovodíkové v methanolu (5.2.2.7).
Thioly se úplně rozpustí (může zbývat malé množství nerozpustného zbytku pomocných látek).Toto je roztok "S".
Na alikvotním podílu tohoto roztoku se jodometricky ověří, že obsah thiolů činí alespoň 90 % hodnoty získané v bodě 5.1.
5.2.5 Methylace
Methylace se provádí buď pomocí přípravy in situ (5.2.5.1), nebo předem připraveným roztokem diazomethanu (5.2.5.2).
5.2.5.1 Methylace in situ
Do methylační aparatury (5.2.3.2) obsahující 1 ml diethyletheru (5.2.2.11) se převede 50 μ1 roztoku "S" a methyluje se postupem (5.2.3.2) s asi 300 mg l-methyl-3-nitro-l-nitrosoguanidinu (5.2.2.8). Po 15 minutách (etherický roztok by měl být žlutý, což indikuje nadbytek diazomethanu) se roztok vzorku převede do nádobky na 2 ml opatřené vzduchotěsnou zátkou. Ponechá se v ledničce přes noc. Methylují se dva vzorky současně.
5.2.5.2 Methylace předem připraveným roztokem diazomethanu
Do nádobky na 5 ml opatřené zátkou se převede 1 ml roztoku diazomethanu (5.2.2.12) a poté 50 μl roztoku "S". Ponechá se v ledničce přes noc.
5.2.6 Příprava standardu
Připraví se standardní roztok kyseliny thioglykolové (5.2.2.1) o známé koncentraci, obsahující asi 60 mg čisté kyseliny thioglykolové (5.2.2.1) ve 2 ml.
Toto je roztok "E".
Vysrážení, zkouška a methylace se provedou tak, jak je popsáno v bodech 5.2.4 a 5.2.5.
5.2.7 Podmínky pro plynovou chromatografii
5.2.7.1 Kolona
Typ: nerezová ocel.
Délka: 2 m.
Průměr: 3 mm.
5.2.7.2 Náplň
20 % didecylftalát/Chromosorb WAW, 80 až 100 mesh.
5.2.7.3 Detektor
Plamenový ionizační. Vhodné nastavení citlivosti elektrometru plamenového ionizačního detektoru je
-10
8 x 10 A.
5.2.7.4 Plyny
Nosný plyn: dusík.
tlak: 2,2 bar,
průtok: 35 ml/min.
Pomocný plyn: vodík.
tlak: 1,8 bar,
průtok: 15 ml/min.
Plyny pro detektor: podle specifikace výrobce přístroje.
5.2.7.5 Teplotní podmínky
Nástřik: 200 °C
Detektor: 200 °C
Kolona: 90 °C.
5.2.7.6 Rychlost posuvu papíru v zapisovači
5 mm/min.
5.2.7.7 Nastřikované množství
3 μl. Provede se pět nástřiků.
5.2.7.8 Chromatografické podmínky jsou uvedeny pouze jako vodítko. Umožní dosáhnout rozlišení "R" rovné nebo lepší než 1,5, kde:
d' (r - r )
2 1
R = 2 ------------
W + W
1 2
kde
r a r = retenční časy dvou píků (v min.),
1 2
W a W = šířka píků v polovině výšky píků (v mm),
1 2
d' = rychlost posuvu papíru (v mm/min.).
Doporučuje se zvyšovat na závěr chromatografíckého měření teplotu z 90 °C na 150 °C rychlostí 10 °C za minutu, aby se vyloučily látky, které by mohly rušit následující měření.
5.2.8 Výpočty
5.2.8.1 Koeficient úměrnosti pro kyselinu thioglykolovou
Počítá se vzhledem k methyloktanoátu na základě standardní směsi.
Označí-li se kyselina thioglykolová jako "t",
přičemž
k = její koeficient úměrnosti,
t
m' = její hmotnost ve směsi (v mg),
t
S' = plocha jejího píku,
t
a označí-li se methyloktanoát jako "c",
přičemž
m' = jeho hmotnost ve směsi (v mg),
c
S' = plocha jeho píku,
c
potom
m' S'
t c
k = --- x ---
t m' S'
c t
Tento koeficient se liší podle použitého přístroje.
5.2.8.2 Koncentrace kyseliny thioglykolové přítomné ve vzorku
Označí-li se kyselina thioglykolová jako "t",
přičemž
k = její koeficient úměrnosti,
t
S = plocha jejího píku,
t
a označí-li se methyloktanoát jako "c",
přičemž
m = jeho hmotnost ve směsi (v mg),
c
S = plocha jeho píku,
c
M = hmotnost původního zkušebního vzorku (v mg),
potom % (m/m) kyseliny thioglykolové přítomné ve vzorku je:
m k x S
c t t
-- x ------- x 100
M S
c