4. Použité chemikálie
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p. a. nebo vyšší a musí být vhodná pro HPLC.
4.1 Methanol
4.2 Dihydrogenfosforečnan draselný
(KH PO )
2 4
4.3 Octan zinečnatý
(Zn(CH COO) . 2H O)
3 2 2
4.4 Kyselina octová
20
d = 1,05)
4
4.5 Hexakyanoželeznatan draselný
(K (Fe(CN) ). 3H O)
4 6 2
4.6 Ethyl-4-hydroxybenzoát
4.7 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoát
4.8 Ethyl-4-aminobenzoát
4.9 Fosfátový tlumivý roztok (0,02M): rozpustí se 2,72 g dihydrogenfosforečnanu draselného (4.2) v 1 litru vody.
4.10 Mobilní fáze: fosfátový tlumivý roztok (4.9)/methanol (4.1) 61/39 (V/V)
Složení mobilní fáze může být změněno s cílem dosáhnout faktoru rozlišení R ≥ 1,5.
d'R - d'R
2 1
R = 2 -----------
W + W
1 2
kde
R a R = retenční časy píků v min.,
1 2
W a W = šířky píků v polovině výšky píků v mm,
1 2
d' = rychlost posuvu papíru v mm/min.
4.11 Zásobní roztok 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu: Naváží se asi 40 mg 2,3-dihydroxypropyl-4-aminobenzoátu přesně a převede se do odměrné baňky na 100 ml. Rozpustí se ve 40 ml methanolu (4.1). Doplní se tlumivým roztokem (4.9) po rysku a promíchá se.
4.12 Zásobní roztok ethyl-4-aminobenzoátu: Naváží se asi 40 mg ethyl-4-aminobenzoátu přesně a převede se do odměrné baňky na 100 ml. Rozpustí se ve 40 ml methanolu (4.1). Doplní se tlumivým roztokem (4.9) po rysku a promíchá se.
4.13 Roztok vnitřního standardu: Naváží se asi 50 mg ethyl-4-hydroxybenzoátu přesně a převede se do odměrné baňky na 100 ml. Rozpustí se ve 40 ml methanolu (4.1). Doplní se tlumivým roztokem (4.9) po rysku a promíchá se.
4.14 Standardní roztoky: Připraví se čtyři standardní roztoky rozpuštěním následujících látek ve 100 ml mobilní fáze (4.10) podle následující tabulky:
+------------+------------------------+------------------------+------------------------+
| Standardní | 2,3-dihydroxypropyl-4- | ethyl-4-aminobenzoát | ethyl-4-hydroxybenzoát |
| roztok | aminobenzoát | | |
+------------+------------+-----------+------------+-----------+-----------+------------+
| | (μg/ml) *) | ml (4.11) | (μg/ml) *) | ml (4.12) | (μg/ml *) | ml (4.13) |
+------------+------------+-----------+------------+-----------+-----------+------------+
| I | 8 | 2 | 8 | 2 | 50 | 10 |
+------------+------------+-----------+------------+-----------+-----------+------------+
| II | 16 | 4 | 12 | 3 | 50 | 10 |
+------------+------------+-----------+------------+-----------+-----------+------------+
| III | 24 | 6 | 16 | 4 | 50 | 10 |
+------------+------------+-----------+------------+-----------+-----------+------------+
| IV | 40 | 10 | 20 | 5 | 50 | 10 |
+------------+------------+-----------+------------+-----------+-----------+------------+
| *) Tyto hodnoty jsou informativní a odpovídají přesným hmotnostem v 4.11, 4.12 |
| a 4.13. |
| Poznámka: Tyto roztoky mohou být připraveny jiným způsobem. |
+---------------------------------------------------------------------------------------+
4.15 Carrezovo činidlo I: Rozpustí se 26,5 g hexakyanoželeznatanu draselného (4.5) ve vodě a doplní se do 250 ml.
4.16 Carrezovo činidlo II: Rozpustí se 54,9 g octanu zinečnatého (4.3) a 7,5 ml kyseliny octové (4.4) ve vodě a doplní se do 250 ml.
4.17 Merck Lichrosorb RP-18, nebo ekvivalentní, s průměrnou velikostí částic 5 μm